ВЭЖХ на основе анализа для мониторинга внеклеточного нуклеотидную / нуклеозид Метаболизм в человека хронический лимфолейкоз клеток

Аденозин (ADO) представляет собой пуриновый нуклеозид с молекулой-аденин прикрепленной к молекуле рибозы фрагмента сахара через гликозидной связи. Когда они присутствуют во внеклеточной среде, он защищает клетки от чрезмерного повреждения под действием иммунной системы. Эта роль была подчеркнута использованием различных моделей заболеваний, таких как колит ^1, сахарный диабет ^2, астма ^3, сепсис ⁴ и ишемического повреждения ^5. Одной из главных функций ADO является ингибирование иммунного ответа у опухоли микроокружения, способствуя опухоли иммунной уклонением ^6. По этой причине, механизмы , участвующие в формировании восклицания и сигнализации представляют значительный терапевтический интерес ^7.

ADO уровни в микросреде ткани являются относительно низкими в нормальных физиологических условиях, и, безусловно, ниже порога чувствительности иммунных клеток. Тем не менее, при гипоксии, ишемии, воспаление, инфекция, метаболическийстресс и трансформация опухоли быстро растут ^8. Повышенные уровни внеклеточного ADO в ответ на сигналы ткани-возмущающих имеют двойную функцию: сообщать повреждение тканей в аутокринном и паракринной образом и генерировать ответы тканей, которые обычно можно рассматривать как Цитопротекторное.

Внеклеточный АДО может быть сформирован с помощью различных механизмов, которые включают высвобождение из внутриклеточных , опосредованных нуклеозидов транспортеров ⁹ или накопления из – за нарушенного деградации эксплуатируемых аденозиндезаминазы. Основной путь, ведущий к увеличению внеклеточного АДО уровней включает в себя действие каскада ectonucleotidases, которые связаны мембранные эктоэнзимов генерирующие ADO путем phosphohydrolysis нуклеотидов, освобожденных из мертвых или умирающих клеток. Этот путь проходит через последовательного действия CD39 (ectonucleoside трифосфат diphosphohydrolase-1), который преобразует внеклеточного аденозин-5'-трифосфата (АТФ) или аденозин 5'-дифосфат (АДФ) с аденозин 5'-монофосфата (AMP) и CD73 (5'-нуклеотидазе), который преобразует AMP в ADO ^10.

Внеклеточной ADO вызывает свои физиологические реакции путем связывания с четырьмя трансмембранных рецепторов ADO, а именно A1, A2A, A2B и А3. Каждый рецептор имеет различные сродством к АДО и специфическим распределением ткани. Все рецепторы имеют семь трансмембранных доменов, и являются G-белок, соединенный с внутриклеточными ГТФ-связывающих белков (G белки), которые могут индуцировать (белок Гс) или ингибируют (Gi белка) активность аденилатциклазы и, в дальнейшем, производство внутриклеточного цАМФ. Таким образом, изменения в цитоплазме влияния уровней цАМФ на внутриклеточный активности протеинкиназы во время физиологических реакций ^11. В физиологических условиях внеклеточного АДО ниже 1 мкМ, который может активировать без разбора A1, A2A и рецепторы A3. Тем не менее, активация A2B подтипа требует значительно выше,Концентрации нуклеозида, такие как те, которые генерируются в патофизиологических условиях. В качестве альтернативы, внеклеточный АДО может разлагаться до инозина (ИНО) путем аденозиндезаминазы (ADA) и CD26, в АДА комплексообразующего белка локализирующем ADA на поверхности клетки. Другая возможность состоит в том, что ADO интернализируется клеткой через equilibrative нуклеозидов транспортеров (ЛОР) и фосфорилируется до АМФ по АДО киназы белка ^12,13.

Целью данного протокола является описание аналитического метода обратной фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ) для количественного определения в одном запуске АМП субстрат и продукты ADO и INO, а порождена лимфоцитов человека. Наш опыт был первоначально получен с использованием клеток от хронического лимфолейкоза (ХЛЛ) пациентов, которые характеризуются расширением зрелого населения CD19 ⁺ / CD5 ⁺ B – лимфоцитов , экспрессирующих CD39 конститутивно ^14,15. Мы показали около 30%ХЛЛ пациенты выражают ectoenzyme CD73 и что этот фенотип коррелирует с плохим прогнозом ^16. Это субпопуляции лейкозных клеток коэкспрессирующей CD39 и CD73 может активно продуцируют внеклеточный ADO из АДФ и / или AMP. Преинкубация CD73 ⁺ клеток ХЛЛ с а, β-метилен-АДФ (APCP), известный ингибитор ферментативной активности CD73, полностью блокирует синтез внеклеточного АДО , подтверждающий , что CD73 представляет собой узкость фермент этого каскада ^16.

ХЛЛ клетки также выражают ADA и ADA комплексообразования белка CD26, которые отвечают за превращение в ADO ИНО. Используя специфические ингибиторы ADA, такие как эритро-9- (2-гидрокси-3-нонил) Я wiadenine (EHNA) гидрохлорид и deoxycoformycin (DCF), можно блокировать внеклеточный деградацию СУЕТЫ в ИНО. Кроме того, предварительная обработка ингибитором ADA в сочетании с дипиридамолом, который блокирует нуклеозидов транспортеров, усиливает накопление в клетке ADOСупернатанты.

Мы затем распространили этот протокол в клетки, полученные из других родов, в том числе Т-лимфоцитов и миелоидных клеток, подтверждающих CD73-зависимого производства ADO. Эти данные позволяют предположить , что этот протокол ВЭЖХ является универсальным и что он может быть применен к дифференцировки различных клеток , и в различных условиях культивирования (рисунок 1).

Рисунок 1. Схематическое изображение ферментативного механизма отвечает за внеклеточного АДО. Аденозин – 5'-трифосфата (АТФ) , и / или аденозин 5'-дифосфат (АДФ) может разлагаться под действием CD39 на аденозин 5'-монофосфат (АМФ), который в свою очередь, преобразуется в CD73 нуклеозида аденозина (ADO). После того, как АДО производится во внеклеточном пространстве, он может повторно ввести клетку через нуклеозидов транспортеров (ЛОР), быть превращено в инозин (ИНО) илисвязываются с различными типами рецепторов P1 ADO. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.