-HPLC baseado Ensaio para monitorar Extracelular Nucleotide / nucleosídeos Metabolismo em crônicas células de leucemia linfocítica Humanos

A adenosina (ADO) é um nucleósido de purina com uma molécula de adenina ligado a uma molécula porção de açúcar ribose através de uma ligação glicosídica. Quando presente no meio extracelular, que protege as células de danos excessivos pela acção do sistema imune. Este papel tem sido destacada usando diferentes modelos de doenças, tais como a colite ^{1, 2} diabetes, asma ^3, sepse ⁴ e lesão isquêmica ^5. Uma das principais funções ADO é a inibição de respostas imunitárias no microambiente tumoral, contribuindo para a evasão do tumor imune ^6. Por esta razão, os mecanismos envolvidos na formação de ADO e de sinalização são de considerável interesse terapêutico ^7.

ADO níveis no microambiente do tecido são relativamente baixas, em condições fisiológicas normais e, certamente, inferior ao limiar de sensibilidade das células imunes. No entanto, durante a hipoxia, isquemia, inflamação, infecção, metabólicastress e transformação do tumor eles aumentam rapidamente ^8. Os elevados níveis ADO extracelular em resposta a sinais de perturbação do tecido tem uma dupla função: relatar lesão do tecido de uma maneira autócrina e parácrina e gerar respostas de tecido que pode ser geralmente visto como citoprotetor.

ADO extracelular pode ser formada através de uma variedade de mecanismos, que incluem a libertação a partir de compartimentos intracelulares mediadas por transportadores de nucleosídeos ⁹ ou acumulação por causa da degradação auditivos operado pela adenosina-desaminase. A principal via que conduz ao aumento dos níveis extracelulares ADO envolve a acção de uma cascata de ectonucleotidases, que são ectoenzimas associadas à membrana, gerando ADO phosphohydrolysis de nucleótidos libertados a partir de células mortas ou a morrer. Esta via prossegue através da ação sequencial de CD39 (trifosfato de ectonucleoside difosfohidrolase-1) que converte extracelular de adenosina 5'-trifosfato (ATP) ou adenosina 5'-difosfato (ADP) em adenosina-5'-monofosfato (AMP) e de CD73 (5'-nucleotidase), que converte a AMP ADO ^10.

Extracelular ADO provoca suas respostas fisiológicas pela ligação a quatro transmembrana ADO receptores, ou seja, A1, A2A, A2B e A3. Cada receptor tem diferentes afinidades para ADO e distribuição do tecido específico. Todos os receptores possuem sete domínios transmembranares e são a proteína G acoplado a proteínas de ligação de GTP intracelular (proteínas G), que pode induzir a (proteína Gs) ou inibir a actividade da adenilato ciclase (proteína Gi) e, subsequentemente, a produção de AMPc intracelular. Portanto, mudanças no citoplasmática impacto níveis acampamento na atividade da proteína quinase intracelular durante as respostas fisiológicas ^11. Sob condições fisiológicas ADO extracelular é abaixo de 1 uM, que podem activar indiscriminadamente A1, A2A e A3 receptores. No entanto, a activação de subtipo A2B requer consideravelmente maiorAs concentrações de nucleósido, tais como os gerados sob condições fisiopatológicas. Alternativamente, o ADO extracelular pode ser degradada de inosina (NOi) por adenosina-desaminase (ADA) e de CD26, uma proteína complexante da ADA localizar ADA na superfície da célula. Outra possibilidade é que o ADO é internalizado pela célula através dos transportadores de nucleosídeos equilibrative (ENT) e fosforilado em AMP por ADO proteína quinase ^12,13.

O objectivo deste protocolo é descrever um método analítico de cromatografia líquida de alta eficiência de fase inversa (RP-HPLC) para quantificar num único ensaio AMP substrato e dos produtos de ADO e Ino, como gerado por linfócitos humanos. A experiência foi inicialmente obtida usando células de pacientes com leucemia linfocítica crónica (LLC), que são caracterizados pela expansão de uma população madura de linfócitos CD19 ⁺ / B CD5 ⁺ constitutivamente expressam CD39 ^14,15. Mostrámos cerca de 30%de CLL pacientes expressam a ectoenzima CD73 e que este fenótipo correlaciona-se com um mau prognóstico ^16. Esta subpopulação de células leucêmicas co-expressam CD39 e CD73 pode produzir ativamente ADO extracelular a partir de ADP e / ou AMP. A pré-incubação de células CD73 ⁺ de CLL com α, síntese ADO extracelular β-metileno-ADP (APCP), um conhecido inibidor da actividade enzimica de CD73, que bloqueia completamente confirmando CD73 representa o enzima gargalo de que cascata ^16.

células CLL expressam também a ADA e a ADA complexação proteína CD26, que são responsáveis ​​pela conversão de ADO dentro INO. Ao utilizar inibidores específicos de ADA, como eritro-9- (2-hidroxi-3-nonil) eu wiadenine (EHNA) e cloridrato de desoxicoformicina (DCF), é possível bloquear a degradação ADO extracelular em INO. Além disso, o pré-tratamento com um inibidor da ADA em combinação com dipiridamol, que bloqueia os transportadores de nucleosídeos, aumenta a acumulação ADO na célulasobrenadantes.

Temos, em seguida, estendeu este protocolo para células derivadas de outros linhagens, incluindo linfócitos T e células mielóides, confirmando produção ADO dependente de CD73. Estes resultados sugerem que este protocolo de HPLC é altamente versátil e que pode ser aplicado a diferentes linhagens celulares e para diferentes condições de cultura (Figura 1).

Figura 1. Representação esquemática da maquinaria enzimática responsável pela produção de ADO extracelular. A adenosina 5'-trifosfato (ATP) e / ou da adenosina-5'-difosfato (ADP) pode ser degradado pela CD39 de adenosina 5'-monofosfato (AMP), a qual por sua vez, é convertido por CD73 para o nucleosídeo adenosina (ADO). Uma vez ADO é produzida no espaço extracelular, pode reinserir a célula através dos transportadores de nucleosídeos (ENT), ser convertidos em inosina (NOi) ouligam-se a diferentes tipos de receptores P1 ADO. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.