HPLC מבוססי Assay לפקח תאיים נוקלאוטיד / מטבוליזם nucleoside בתאי לוקמיה לימפוציטית כרונית
Summary
The protocol described here represents an easy and reproducible method that employs reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) to measure purine metabolism on chronic lymphocytic leukemia (CLL) cells cultured under different conditions.
Abstract
שיטה זו מתארת שלב הפוך רגישה, ספציפית, אמינה לשחזור כרומטוגרפיה נוזלית בעל ביצועים גבוהים (RP-HPLC) שפותח assay ומאומת עבור כימות של נוקלאוטידים purine התאיים ו נוקלאוזידים המיוצרים על ידי לוקמיה לימפוציטית כרונית מטוהרים (CLL) תאים בתנאי תרבות אחרים . ההפרדה chromatographic של אדנוזין 5'-monophosphate (AMP), אדנוזין (ADO) ו inosine (INO) מתבצע ב RT על מבוסס-סיליקה, עמודה התהפכה פאזי המשמש עבור החזקת מתחם הקוטב. השיטה כוללת שלב ניידים בינארי, אשר מורכב של אמוניום אצטט 7 מ"מ ו אצטוניטריל עם קצב הזרימה של 1.00 מ"ל / דקה. את eluates מנוטרים באמצעות גלאי UV photodiode המערך להגדיר ב 260 ננומטר. עקומת כיול סטנדרטית מופקת לחשב את המשוואה עבור כימות אנליטי של כל מתחם purine. מערכת בקרה, רכישת נתונים וניתוח מבוצעים מכן. החלת פרוטוקול זה, AMP, INO ו ADO elute ב -7, 11 ו -11.9 דקות, בהתאמה, ואת זמן הריצה הכולל עבור כל דגימה היא 20 דקות. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על תאים מסוגים שונים שורות תאים (הן השעיה חסידה), באמצעות תקשורת והתרבות כמטריצה. היתרונות הם הכנת מדגם קלה ומהירה לבין הדרישה של כמות קטנה של supernatant לניתוח. יתר על כן, השימוש של מדיום סרום ללא מאפשר לדלג על השלב משקעים חלבון עם אצטוניטריל כי משפיע על הריכוז הסופי של תרכובות purine. אחת המגבלות של השיטה זו היא הדרישה של טור האיזון לרוץ לפני כל ריצת מדגם יחידה, מה שהופך את זמן ריצה הכולל של הניסוי כבר ומניעת יישומי הקרנת תפוקה גבוהה.
Introduction
אדנוזין (ADO) הוא nucleoside purine עם מולקולת אדנין מחוברת מחצית מולקולת סוכר ריבוז באמצעי קשר glycosidic. כאשר נוכח הסביבה התאית, הוא מגן על תאים מפני ניזק מופרז על ידי הפעולה של המערכת החיסונית. תפקיד זה כבר מסומן באמצעות מודלים מחלה שונים, כגון קוליטיס 1, סוכרת 2, אסטמה 3, אלח דם 4, ו איסכמי פציעה 5. אחד התפקידים ADO העיקרית היא עיכוב של התגובה החיסונית במיקרו-סביבה של הגידול, תורם התחמקות החיסונית הגידול 6. מסיבה זו, המנגנונים המעורבים ביצירה ואיתות ADO הם עניין טיפולי ניכר 7.
רמות ADO ב במייקרו-הסביבה של הרקמה נמוכות יחסית בתנאים פיסיולוגיים נורמלים בהחלט מתחת לסף הרגישות של תאי מערכת חיסון. עם זאת, במהלך היפוקסיה, איסכמיה, דלקת, זיהום, מטבוליתמתח וטרנספורמציה הגידול הם מעלים במהירות את רמות 8. רמות ADO התאיות הגבוהות בתגובה לאותות perturbing-רקמה יש תפקיד כפול: לדווח פגיעה ברקמות בצורת autocrine ו paracrine וכדי ליצור תגובות רקמות כי ניתן לראות בדרך כלל cytoprotective.
תאי ADO יכול להיוצר באמצעות מגוון רחב של מנגנונים, הכוללים שחרור תאים תאיים בתיווך מובילי nucleoside 9 או הצטברות בגלל שפלה לקויה המופעלת על ידי deaminase אדנוזין. הדרך הראשית המובילה לרמות ADO התאיות גדילה כרוכה הפעולה של מפל של ectonucleotidases, אשר קשור קרום ectoenzymes יצירת ADO ידי phosphohydrolysis של נוקלאוטידים שוחרר מבית התאים מתים או גוססים. מסלול זה מתנהל באמצעות הפעולה הרציפה של CD39 (אדנוזין ectonucleoside diphosphohydrolase-1) הממיר 5'-אדנוזין אדנוזין התאי (ATP) או 5'-diphosphate אדנוזין (ADP) כדי אדנוזין 5'-monophosphate (AMP) ושל CD73 (5'-nucleotidase), אשר ממירה AMP כדי ADO 10.
תאי ADO מעורר תגובות פיזיולוגיות שלה באמצעות קשירה ארבע הטרנסממברני ADO קולטנים, כלומר A1, A2A, A2B ו- A3. לכל קולטן זיקות שונות ADO והפצת רקמות ספציפית. כל הקולטנים יש שבעה תחומים הטרנסממברני והם G- חלבון מצומדים לחלבוני GTP מחייב תאיים (חלבוני G), שיכול לגרום (חלבון G) או לעכב (Gi חלבון) פעילות cyclase adenylate, ועקב כך גם את הייצור של cAMP התאי. לכן, שינויי השפעת רמות cAMP cytoplasmic על פעילות קינאז חלבון תאית במהלך תגובות פיסיולוגיות 11. בתנאים פיסיולוגיים ADO התאי הוא מתחת ל -1 מיקרומטר, אשר יכול להפעיל ללא אבחנה A1, A2A ואת הקולטנים A3. עם זאת, ההפעלה תת סוג A2B דורשת גבוהה באופן משמעותיריכוזים של nucleoside, כמו אלה שנוצרו בתנאים pathophysiological. לחלופין, יכול להיות מושפל ADO תאי inosine (INO) על ידי deaminase אדנוזין (ADA) ו CD26, חלבון complexing ADA ללוקליזציה ADA על פני התא. אפשרות אחרת היא כי ADO מופנם על ידי התא דרך מובילי nucleoside equilibrative (אף אוזן גרון) ו פוספורילציה כדי AMP ידי חלבון קינאז ADO 12,13.
מטרת פרוטוקול זה היא לתאר שיטה אנליטית של כרומטוגרפיה נוזלית הפוכה שלב בעל ביצועים גבוהים (RP-HPLC) לכמת בטווח אחת את AMP המצע לבין ADO המוצרים INO, כפי שנוצר על ידי לימפוציטים האדם. הניסיון שלנו הושג בתחילה באמצעות תאים מלוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL) חולים, המאופיינים על ידי התרחבות של אוכלוסייה מבוגרת של CD19 + / CD5 + B לימפוציטים constitutively להביע CD39 14,15. הראינו כ 30%חולים של CLL לבטא את ectoenzyme CD73 וכי פנוטיפ זה בקורלציה עם פרוגנוזה גרועה 16. תת-אוכלוסייה זו של תאים leukemic שיתוף להביע CD39 ו CD73 יכול לייצר ADO תאיים פעיל מ ADP ו / או AMP. Preincubation של תאי CD73 + CLL עם α, β-מתילן-ADP (APCP), מעכב ידוע של פעילות האנזימטית CD73, חוסמות לחלוטין סינתזת ADO התאי המאשר כי CD73 מייצג את האנזים-צוואר בקבוק כי המפל 16.
תאי CLL גם להביע ADA ואת CD26 חלבון complexing ADA, אשר אחראים על ההמרה של ADO לתוך INO. באמצעות מעכבי ADA ספציפיים, כגון erythro-9- (2-הידרוקסי-3-nonyl) אני wiadenine (EHNA) hydrochloride ו deoxycoformycin (DCF), אפשר לחסום השפלה ADO תאיים לתוך INO. יתר על כן, טיפול מקדים מעכב ADA בשילוב עם דיפירידאמול, כי מובילי nucleoside בלוקים, משפר הצטברות ADO בתאsupernatants.
אז הרחבנו בפרוטוקול זה כדי בתאים שמקורם במשפחות אחרות, כוללים לימפוציטים מסוג T ותאי מיאלואידית, המאשר ייצור ADO תלוי CD73. ממצאים אלה מראים כי פרוטוקול HPLC זה תכליתי מאוד וכי זה יכול להיות מיושם על שושלות תאים שונות לתנאי תרבות אחרים (איור 1).
באיור 1. ייצוג סכמטי של מכונות האנזימטית הגורמת לייצור ADO תאיים. אדנוזין 5'-אדנוזין (ATP) ו / או אדנוזין 5'-diphosphate (ADP) יכול להיות מושפל על ידי CD39 כדי אדנוזין 5'-monophosphate (AMP), אשר בתורו מומר על ידי CD73 לתוך אדנוזין nucleoside (ADO). לאחר ADO מופק במרחב תאיים, היא עשויה להזין את התא דרך מובילי nucleoside (אף אוזן גרון), יומרו inosine (INO) אולאגד סוגים שונים של קולטנים ADO P1. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר להעריך את הפעילות של מכונות CD39 / CD73 adenosinergic במדיה תרבית תאי מתאי leukemic אדם מטוהרים. באמצעות שיטה זו HPLC שנוכל לעקוב וכמותית למדוד את הדור האנזימטית של ADO (CD73-תלוי) והשפלה הבאה שלה כדי INO (CD26 / ADA התלוי). שימוש מעכבי אנזים מאפשר לשלוט בפרוטוקול וכן י…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי Associazione Italiana Ricerca Cancro (IG # 12754).
Materials
| Human blood | |||
| Milli-Q water | Millipore | double deionised water | |
| Ficoll-Paque Plus | GE-Healthcare | 17-1440-03 | |
| purified anti-CD3, -CD14, -CD16 | made in-house | mouse monoclonal | |
| PE-labeled anti-CD19 | Miltenyi Biotec | 120-014-229 | |
| FITC-labeled anti-CD5 | Miltenyi Biotec | 130-096-574 | |
| Dynabeads sheep anti-mouse IgG | Invitrogen | 11031 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Amresco | E404-200TABS | tablets |
| bovine serum albumin (BSA) | ID bio | 1000-70 | standard grade |
| isolation buffer | PBS 0.1 % BSA 2 mM EDTA, pH 7.4 | ||
| AIM V serum free medium | GIBCO | 12055-091 | liquid (research grade) |
| adenosine 5’-diphosphate (ADP) | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| adenosine 5’-monosphate (AMP) | Sigma-Aldrich | A1752 | |
| adenosine (ADO) | Sigma-Aldrich | A9251 | |
| inosine (INO) | Sigma-Aldrich | I4125 | |
| α,β-methylene-ADP (APCP) | Sigma-Aldrich | M8386 | CD73 inhibitor |
| EHNA hydrochloride | Sigma-Aldrich | E114 | adenosine deaminase inhibitor |
| Deoxycoformycin (dCF) | Tocris | 2033 | adenosine deaminase inhibitor |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dipyridamole | Sigma-Aldrich | D9766 | nucleoside transporter inhibitor |
| acetonitrile (CHROMASOLV Plus) | Sigma-Aldrich | 34998 | HPLC-grade |
| ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 9688 | 7 mM, pH 3.0 |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 30721-1L | min. 37 % |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Bürker cell counter | VWR | 631-0920 | hemocytometer |
| DynaMag-15 Magnet | Invitrogen | 12301D | Dynal magnetic bead separator |
| microcentrifuge safe-lock tubes | Eppendorf | 030-120-0086 | 1.5 ml |
| PET centrifuge tubes | Corning | 430053/430304 | 15 – 50 ml |
| Minisart RC4 syringe filters | Sartorius Stedim Biotech | 17821 | membrane 0.2 µm |
| short thread vials | VWR | 548-0029 | 1.5 ml/glass |
| micro-inserts | VWR | 548-0006 | 0.1 ml/glass |
| screw caps | VWR | 548-0085 | 9 mm/PP blue |
| Atlantis dC18 Column | Waters | 186001344 | 5 µm, 4.6 x 150 mm |
| Atlantis dC18 Guard Column | Waters | 186001323 | 5 µm, 4.6 x 20 mm |
| Waters Alliance 2965 Separations Module | Waters | HPLC separation module | |
| Waters 2998 Photodiode Array (PDA) Detector | Waters | UV detector | |
| Waters Empower2 software | Waters |
References
- Naganuma, M., Wiznerowicz, E. B., Lappas, C. M., Linden, J., Worthington, M. T., Ernst, P. B. Cutting edge: Critical role for A2A adenosine receptors in the T cell-mediated regulation of colitis. J Immunology. 177 (5), 2765-2769 (2006).
- Nemeth, Z. H., et al. Adenosine receptor activation ameliorates type 1 diabetes. FASEB J. 21 (10), 2379-2388 (2007).
- Fan, M., Jamal Mustafa, S. Role of adenosine in airway inflammation in an allergic mouse model of asthma. Int Immunopharmacol. 6 (1), 36-45 (2006).
- Csoka, B., et al. A2B adenosine receptors protect against sepsis-induced mortality by dampening excessive inflammation. J Immunol. 185 (1), 542-550 (2010).
- Peart, J. N., Headrick, J. P. Adenosinergic cardioprotection: multiple receptors, multiple pathways. Pharmacol Ther. 114 (2), 208-221 (2007).
- Ohta, A., et al. A2A adenosine receptor protects tumors from antitumor T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (35), 13132-13137 (2006).
- Hasko, G., Linden, J., Cronstein, B., Pacher, P. Adenosine receptors: therapeutic aspects for inflammatory and immune diseases. Nat Rev Drug Discov. 7 (9), 759-770 (2008).
- Cronstein, B. N. Adenosine, an endogenous anti-inflammatory agent. J Appl Physiol (1985). 76 (1), 5-13 (1994).
- Molina-Arcas, M., Casado, F. J., Pastor-Anglada, M. Nucleoside transporter proteins. Curr Vasc Pharmacol. 7 (4), 426-434 (2009).
- Deaglio, S., et al. Adenosine generation catalyzed by CD39 and CD73 expressed on regulatory T cells mediates immune suppression. J Exp Med. 204 (6), 1257-1265 (2007).
- Linden, J. Regulation of leukocyte function by adenosine receptors. Adv Pharmacol. 61, 95-114 (2011).
- Antonioli, L., Blandizzi, C., Pacher, P., Hasko, G. Immunity, inflammation and cancer: a leading role for adenosine. Nat Rev Cancer. 13 (12), 842-857 (2013).
- Antonioli, L., Csoka, B., Fornai, M., et al. Adenosine and inflammation: what’s new on the horizon. Drug Discov Today. 19 (8), 1051-1068 (1051).
- Chiorazzi, N., Rai, K. R., Ferrarini, M. Chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med. 352 (8), 804-815 (2005).
- Abousamra, N. K., Salah El-Din, M., Hamza Elzahaf, E., Esmael, M. E. Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase-1 (E-NTPDase1/CD39) as a new prognostic marker in chronic lymphocytic leukemia. Leuk Lymphoma. 56 (1), 113-119 (2015).
- Serra, S., et al. CD73-generated extracellular adenosine in chronic lymphocytic leukemia creates local conditions counteracting drug-induced cell death. Blood. 118 (23), 6141-6152 (2011).
- Chen, L. S., Keating, M. J., Gandhi, V. Blood collection methods affect cellular protein integrity: implications for clinical trial biomarkers and ZAP-70 inn CLL. Blood. 124 (7), 1192-1195 (2014).
- Kalina, T., et al. EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols. Leukemia. 26 (9), 1986-2010 (2012).
- Deaglio, S., et al. CD38 and ZAP-70 are functionally linked and mark CLL cells with high migratory potential. Blood. 110 (12), 4012-4021 (2007).
- Sachsenmeier, K. F., et al. Development of a novel ectonucleotidase assay suitable for high-throughput screening. J Biomol Screen. 17 (7), 993-998 (2012).
