HPLC-basierten Assay extrazelluläre Nucleotid / Nukleosid Metabolismus in menschlichen chronischer lymphatischer Leukämie-Zellen zu überwachen

Adenosine (ADO) ist ein Purin-Nukleosid mit einem Adenin-Molekül an einem Ribose Molekülteil durch eine glycosidische Bindung. Wenn sie vorhanden sind in der extrazellulären Umgebung, schützt Zellen vor übermäßigen Beschädigung durch die Wirkung des Immunsystems. Diese Rolle wurde mit verschiedenen Krankheitsmodellen hervorgehoben, wie Colitis ^1, Diabetes ^2, Asthma ^3, Sepsis ⁴ und ischämische Verletzung ^5. Eine der Hauptfunktionen ADO ist die Hemmung von Immunreaktionen in der Tumor – Mikroumgebung, einen Beitrag zur Tumor Immunevasion ^6. Aus diesem Grund sind die beteiligten Mechanismen in ADO Bildung und Signalisierung von erheblicher therapeutischem Interesse ^7.

ADO-Spiegel im Gewebe Mikroumgebung sind relativ gering unter normalen physiologischen Bedingungen und mit Sicherheit unterhalb der Nachweisgrenze von Immunzellen. Jedoch während Hypoxie, Ischämie, Entzündung, Infektion, StoffwechselStress und Tumortransformation sie schnell zu erhöhen ^8. Die erhöhten extrazellulären ADO Ebenen in Reaktion auf gewebe Störsignale haben eine Doppelfunktion: Gewebeverletzung in einer autokrinen und parakrinen Weise zu berichten und Gewebereaktionen zu erzeugen, die im Allgemeinen als zytoprotektive betrachtet werden können.

Die extrazelluläre ADO kann durch eine Vielzahl von Mechanismen gebildet werden, die die Freisetzung umfassen von intrazellulären Kompartimenten vermittelt durch Nukleosid – Transporter ⁹ oder Anhäufung wegen gestörten Abbau von Adenosindeaminase betrieben. Der Hauptweg zu einer erhöhten extrazellulären ADO-Niveaus führt beinhaltet die Wirkung einer Kaskade von ectonucleotidases, welche Membran Ectoenzyme assoziiert ADO durch phosphohydrolysis von Nukleotiden veröffentlicht von toten oder sterbenden Zellen zu erzeugen. Dieser Weg verläuft durch die sequentielle Wirkung von CD39 (ectonucleoside Triphosphat diphosphohydrolase-1), die 5'-triphosphat extrazellulärem Adenosin umwandelt (ATP) oder Adenosin – 5'-diphosphat (ADP) zu Adenosin – 5'-Monophosphat (AMP) und CD73 (5'-nucleotidase), die AMP wandelt ¹⁰ bis ADO.

Die extrazelluläre ADO entlockt seiner physiologischen Reaktionen von vier Trans ADO Rezeptoren binden, nämlich A1, A2A, A2B und A3. Jeder Rezeptor hat unterschiedliche Affinitäten für ADO und spezifische Gewebeverteilung. Alle Rezeptoren besitzen sieben Transmembrandomänen und sind G-Protein-gekoppelten intrazellulären GTP-bindende Proteine ​​(G-Proteine), die veranlassen können (Gs-Protein) oder inhibieren (Gi-Protein) Adenylat-Cyclase-Aktivität und anschließend die Produktion von intrazellulärem cAMP. Daher ändert in cytoplasmatischen cAMP Niveaus Einfluss auf die intrazelluläre Protein – Kinase – Aktivität während der physiologischen Reaktionen ^11. Unter physiologischen Bedingungen ist extrazelluläre ADO unter 1 & mgr; M, die wahllos A1, A2A und A3-Rezeptoren aktivieren kann. Jedoch erfordert die Aktivierung von A2B-Subtyp wesentlich höherKonzentrationen des Nukleosids, wie die unter pathophysiologischen Bedingungen erzeugt. Alternativ kann extrazellulär ADO zu Inosin (INO) durch Adenosin-Deaminase (ADA) und CD26 abgebaut werden, ein ADA komplexierende Protein lokalisierende ADA auf der Zelloberfläche. Eine andere Möglichkeit ist , dass ADO von der Zelle durch die äquilibrierenden Nukleosid – Transporter (ENT) und phosphoryliert zu AMP durch ADO – Kinase Protein ^12,13 internalisiert wird.

Das Ziel dieses Protokolls ist eine analytische Methode der Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (RP-HPLC) zu beschreiben, in einem einzigen Durchlauf des Substrats AMP und die Produkte ADO und INO, zu quantifizieren, wie durch menschliche Lymphozyten erzeugt. Unsere Erfahrung war zunächst erhaltenen Zellen von chronischer lymphatischer Leukämie (CLL) mit, die durch die Expansion eines reifen Population von CD19 ⁺ / CD5 ⁺ B – Lymphozyten konstitutiv gekennzeichnet exprimieren CD39 ^14,15. Wir zeigten etwa 30%Patienten von CLL exprimieren das CD73 Ektoenzym und dass dieser Phänotyp korreliert mit einer schlechten Prognose ^16. Diese Subpopulation von leukämischen Zellen co-exprimierenden CD39 und CD73 können aktiv extrazelluläre ADO von ADP und / oder AMP produzieren. Vorinkubation von CD73 ⁺ CLL – Zellen mit α, β-Methylen-ADP (APCP), ein bekannter Inhibitor der CD73 enzymatischer Aktivität, vollständig blockiert extrazellulärem ADO Synthese bestätigt , dass CD73 die Flaschenhals – Enzym dieser Kaskade ¹⁶ darstellt.

CLL-Zellen exprimieren auch ADA und die ADA Komplexbildung Protein CD26, die für die Umwandlung von ADO in INO verantwortlich sind. Durch die Verwendung von spezifischen ADA-Inhibitoren, wie erythro-9- (2-Hydroxy-3-nonyl) I wiadenine (EHNA) hydrochlorid und Desoxycoformycin (dCF) ist es möglich, extrazelluläre ADO Degradation INO zu blockieren. Weiterhin Vorbehandlung mit einem ADA-Inhibitor in Kombination mit Dipyridamol, dass Nukleosid-Transporter-Blöcke erhöht ADO Akkumulation in ZellenStände.

Wir haben dann dieses Protokoll zu Zellen von anderen Abstammungslinien, einschließlich T-Lymphozyten und myeloischen Zellen, bestätigt CD73-abhängige ADO Produktion abgeleitet erweitert. Diese Ergebnisse legen nahe , dass diese HPLC – Protokoll sehr vielseitig ist und dass es an verschiedene Zelllinien angewendet werden kann und auf unterschiedliche Kulturbedingungen (Abbildung 1).

Abbildung 1. Schematische Darstellung der enzymatischen Maschinerie verantwortlich für extrazelluläre ADO – Produktion. Adenosin – 5'-Triphosphat (ATP) und / oder Adenosin – 5'-diphosphat (ADP) durch CD39 an Adenosin – 5'-Monophosphat (AMP) abgebaut werden, die wiederum von CD73 in das Nukleosid Adenosin (ADO) umgewandelt. Sobald ADO in den extrazellulären Raum erzeugt wird, kann es die Zelle durch die Nukleosid-Transporter (ENT) erneut einzugeben, in Inosin umgewandelt werden (INO) oderbinden an verschiedene Typen von P1 ADO – Rezeptoren. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.