-HPLC gebaseerde test voor Monitor extracellulaire Nucleotide / Nucleoside Metabolism in Human Chronische Lymfatische Leukemie Cellen

Adenosine (ADO) is een purine nucleoside met een adenine molecule via een glycosidische binding gehecht aan een ribose suiker molecuul groep. Wanneer aanwezig in het extracellulaire milieu beschermt de cellen tegen overmatige beschadiging door de werking van het immuunsysteem. Deze rol is aangegeven door middel van verschillende ziektemodellen, zoals colitis ^{1, 2} diabetes, astma ^{3, 4} sepsis en ischemisch letsel ^5. Een van de belangrijkste functies ADO de remming van immuunresponsen bij de tumor micro bijdragen aan tumor immune evasion ^6. Daarom zijn de bij ADO vorming en signalering mechanismen van aanzienlijk therapeutisch belang ^7.

ADO niveaus in het weefsel micro relatief laag onder normale fysiologische omstandigheden en zeker onder de drempel van immuuncellen. Echter, tijdens hypoxie, ischemie, ontsteking, infectie, metabolestress en tumor transformatie ze snel toenemen ^8. De verhoogde ADO extracellulaire niveaus als reactie op weefsel storende signalen een dubbele functie: weefselschade melden op een autocriene en paracriene manier en weefselreacties die in het algemeen kan worden beschouwd als cytoprotectieve genereren.

Extracellulaire ADO kan worden gevormd door een verscheidenheid van mechanismen, die afgifte van intracellulaire compartimenten gemedieerd door nucleoside transporteurs ⁹ of accumulatie vanwege verminderde afbraak uitgevoerd door adenosine deaminase bevatten. De belangrijkste route leidend tot verhoogde extracellulaire ADO niveaus gaat de werking van een cascade van ectonucleotidases dat membraangeassocieerd ectoenzymes genereren ADO door phosphohydrolysis nucleotiden vrij van dode of stervende cellen. Deze route gaat via de opeenvolgende werking van CD39 (ectonucleoside trifosfaat diphosphohydrolase-1), die extracellulaire adenosine 5'-trifosfaat omgezet (ATP) of adenosine-5'-difosfaat (ADP) adenosine 5'-monofosfaat (AMP) en CD73 (5'-nucleotidase), die wordt omgezet AMP ADO ^10.

Extracellulaire ADO lokt haar fysiologische reacties door te binden aan vier transmembraan ADO-receptoren, te weten A1, A2A, A2B en A3. Elke receptor heeft verschillende affiniteiten voor ADO en specifieke verdeling weefsel. Alle receptoren hebben zeven transmembraandomeinen en zijn G-proteïne gekoppelde intracellulaire GTP-bindende eiwitten (G-eiwitten), die kan induceren (Gs eiwit) of remmen (Gi-eiwit) adenylaatcyclase-activiteit en vervolgens de productie van intracellulair cAMP. Daarom veranderingen in cytoplasmatische cAMP effect op intracellulair proteïne kinase activiteit tijdens fysiologische reacties ^11. Onder fysiologische omstandigheden extracellulaire ADO is dan 1 uM, die zonder onderscheid A1, A2A en A3 receptoren activeert. De activering van A2B subtype vereist aanzienlijk hogereconcentraties van het nucleoside, bijvoorbeeld ontstaan ​​onder pathofysiologische omstandigheden. Alternatief kan extracellulaire ADO worden afgebroken tot inosine (INO) van adenosine deaminase (ADA) en CD26, een ADA complexerende eiwit lokaliseren ADA op het celoppervlak. Een andere mogelijkheid is dat ADO wordt geïnternaliseerd door de cel door de equilibrerende nucleoside transporters (KNO) en gefosforyleerd aan AMP door ADO kinase eiwit ^12,13.

Het doel van dit protocol is een analytische werkwijze voor omgekeerde fase hoge prestatie vloeistofchromatografie (RP-HPLC) beschrijven kwantificeren in een enkele run het substraat AMP en de producten ADO en INO, zoals gegenereerd door menselijke lymfocyten. Onze ervaring was oorspronkelijk verkregen met cellen van chronische lymfocytische leukemie (CLL) patiënten, die worden gekenmerkt door de expansie van een volwassen populatie van CD19 ⁺ / CD5 ⁺ B-lymfocyten constitutief CD39 ^14,15. We toonden ongeveer 30%van CLL drukken de CD73 ecto-enzym en dat dit fenotype correleert met een slechte prognose ^16. Deze subpopulatie van leukemische cellen co-expressie CD39 en CD73 kunnen actief produceren extracellulaire ADO van ADP en / of AMP. Voorincubatie van CD73 ⁺ CLL cellen met α, β-methyleen-ADP (APCP), een bekende remmer van CD73 enzymatische activiteit blokkeert volledig extracellulaire ADO synthese bevestigd dat CD73 vertegenwoordigt het knelpunt enzym van deze cascade ^16.

CLL cellen ook de expliciete ADA en het ADA complexerende eiwit CD26, die verantwoordelijk zijn voor de omzetting van ADO in INO zijn. ADA door specifieke remmers, zoals erythro-9- (2-hydroxy-3-nonyl) I wiadenine (EHNa) hydrochloride en deoxycoformycine (dCF), is het mogelijk om ADO extracellulaire afbraak blok in INO. Bovendien voorbehandeling met een ADA-remmer in combinatie met dipyridamol, blokkeert nucleoside transporteurs, verbetert ADO accumulatie in celsupernatanten.

We hebben vervolgens uitgebreid dit protocol om cellen afkomstig van andere geslachten, waaronder T-lymfocyten en myeloïde cellen bevestigt CD73-afhankelijke ADO productie. Deze bevindingen suggereren dat dit HPLC protocol is zeer veelzijdig en kan worden toegepast op verschillende cellijnen en verschillende kweekomstandigheden (figuur 1).

Figuur 1. Schematische weergave van de enzymatische machinerie belast extracellulaire ADO productie. Adenosine 5'-trifosfaat (ATP) en / of adenosine 5'-difosfaat (ADP) kan worden afgebroken door CD39 adenosine 5'-monofosfaat (AMP), die op zijn beurt wordt omgezet door CD73 in de nucleoside adenosine (ADO). Zodra ADO wordt in de extracellulaire ruimte, kan de cel door de nucleoside transporteurs (ENT) opnieuw in te voeren, worden omgezet in inosine (INO) ofbinden aan verschillende types van P1 ADO receptoren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.