ヒストンの抽出からデータ解析まで：ボトムアップ質量分析法を用いてヒストンの翻訳後修飾の解析のための完全なワークフロー

文化からの細胞の1コレクション細胞を懸濁液中で成長させた場合に、5分間、300 RCFでの遠心分離によって細胞を収集します。付着した場合、吸引および細胞培地を捨てます。 Ca 2+およびMg 2+を含まないPBSで付着した細胞を洗浄（PBSは、今後とも呼ばれます）。細胞は、（時間が異なる細胞株について異なる）デタッチするまで、37℃でプレートの表面を被覆するのに十分な量で – （0.5％は、細胞株に応じて0.025％）トリプシン又はトリプシンEDTAのいずれかで細胞をインキュベートします。 5分間300 RCFの遠心分離によって細胞を収集します。 PBSで細胞を2回洗浄し、遠心分離によって収集します。 卒業から約パック細胞容積を推定1.8ミリリットルチューブまたは15ミリリットルコニカルチューブにマーク。 注：培養物から細胞を液体窒素中でスナップ凍結し、この段階で-80℃で無期限に保存することができます。 無傷の細胞からの核の2の単離</P> 氷上で細胞を解凍します。 解凍核単離緩衝液（NIB、 表1）。 すべての100μlのパック細胞容積は約5ミリリットルNIBバッファー（ 表1）を準備します。 1 M DTTを1μl、200mMのAEBSF、2.5μMのミクロシスチンと5 M酪酸ナトリウムの2μlに2μlの2.5μLを次のようにすべての1ミリリットルNIBバッファのために、プロテアーゼ阻害剤を添加し、安定化剤。阻害剤とのNIBは、この時点からNIBと呼ぶことにします。 注：ヒストンのリン酸化が検討されている場合、EDTAフリープロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテルを含みます。 NIBバッファの第五の容量このようにして調製を削除し、0.2％の最終濃度にNP-40の代替（ 表1）を追加します。残りの4つの五量は、洗浄のために使用されます。 NP-40の代替率なしNIB 1:10細胞ペレットで洗浄細胞ペレット（v / v）です。 5分間700 RCFで遠心分離して上清を取り除きます。 溶解CEL氷の上に置き、0.2％NP-40の代替とNIB 1:10細胞ペレットを添加することにより、Lペレット（v / v）です。 組織サンプルから抽出する場合は、乳鉢と乳棒またはダウンスホモジナイザーを用いてホモジナイズします。培養細胞を穏やかなピペッティングにより均質化することができます。 10分 – 5のために氷上でホモジナイズした細胞をインキュベートします。細胞は核を溶解し、解放します。 4℃で10分 – 5 1,000 RCFで遠心分離します。上清は、主に細胞質成分が含まれていながら、ペレットは、主に細胞核に含まれています。所望であれば、細胞質画分を保存します。 優しくNP-40の代替なし1：10（v / v）のNIBでそれを再懸濁することにより核ペレットを洗浄。 注：この洗浄工程の前核からヒストンを抽出する界面活性剤の痕跡を除去するためだけです。 4°Cで5分間千RCFで遠心分離し、上清を除去します。 繰り返しステップ2.10から2.11に少なくとも2回完全NP-40の代替を除去します。 NP-40の代替の除去は明らかaは洗浄工程は、もはや気泡を形成中に、穏やかにピペッティングしね。 組織からのヒストンの抽出のための： 氷のように冷たいNIB新鮮なまたは解凍した凍結組織をすすぎます。 ウェットティッシュを維持するだけの十分な、NIBと氷の上に置いたペトリ皿に組織を転送します。 核の単離のための表面接触を増加させるためにカミソリの刃を有する最小個（<1 mm）の中にダイス。 予備冷却ホモジナイザーに細分化した組織を移し、ピペッティングによりNIBで洗います。 5分間300 RCFで遠心分離することにより、バッファを削除してください。 細胞中の細胞にNIB含むNP-40の代替を追加します：1時10分の比率をバッファ（v / v）であり、5によって均質化 – 10ストローク。 細胞溶解を確認し、必要に応じて均質化を繰り返します。細胞が溶解されていることを示す良い指標は、ペレット容積の減少です。ペレットは、核のみを含める必要があります。 5分間700 RCFで遠心し、ペレットを保存します。 2より多くの時間 – このペレットは1を抽出することができますNP-40を含有する代替NIBの1:10（v / v）の中での、この段階で、ヒストンは、クロマチンから抽出され、ペレットが著しく収縮しています。 洗剤の痕跡を除去するためにNP40代替することなく、NIBの3ミリリットル – 2で2回洗浄します。 注：中間停止点：サンプルは、NIB + 5％グリセロールの最小体積で再懸濁し、-80℃で保存することができます。 核からのヒストンの3抽出および精製注：ヒストンはしっかりとDNAのリン酸骨格と相互作用するそれらを可能にする、塩基性アミノ酸残基が非常に豊富です。ヒストンは、核内の最も基本的なタンパク質の一つである、従ってそれらを強酸で沈殿非ヒストンタンパク質からの最小限の汚染との氷冷硫酸（0.2 MH 2 SO 4）で抽出することを可能にします。 （33％の最終濃度まで）高濃度のTCAは、次いで硫酸からヒストンを沈殿させるために使用することができます酸。 TCAは、4℃で褐色瓶100％として格納されます。 1での再懸濁細胞核：5（V / V）を、穏やかにピペッティングにより0.2 MH 2 SO 4（ 表1）を冷やし。 4℃で4時間 – 一定の回転または2のために穏やかに振盪しながらサンプルをインキュベートします。一般的に、500以上のμlの細胞ペレットを有するサンプルのために、2時間の抽出は、ヒストンを抽出するのに十分です。より長いインキュベーションは、他の塩基性タンパク質の抽出をもたらし得ます。小さい核ペレットについて（<200μl）を、4時間の抽出は、より良い歩留まりを提供します。 5分間、4℃で3400 RCFで遠心分離します。 上清を新しいチューブに移します。 任意の不溶性物質を除去するために3.4 – 手順3.3を繰り返します。 ヒストンを沈殿させ、1の比で（現在ヒストンを含む）を回収した上清に冷却した100％TCA（ 表1）を追加：3（v / v）で、33％の最終TCA濃度を得るために。チューブを数トンを転倒混和IME。 注：サンプルは、ヒストンの存在を示す、TCAのほかに曇っなります。 少なくとも1時間氷上で混合物をインキュベートします。小さい出発ペレットサイズの場合、一晩沈殿が推奨されます。 5分間3400 RCFで遠心分離します。また、チューブの側面と底に堆積ヒストンコート。白い不溶性ペレットはまた、主に非ヒストンタンパク質および他の生体分子が含まれているチューブの一番下に形成しています。慎重に両側またはペレットを掻き取ることなく、吸引により上清を取り除きます。 側面および底面を被覆する沈殿したタンパク質を覆うようにガラスパスツールピペットを用いて、氷冷アセトン+ 0.1％のHCl（ 表1）を用いてチューブをリンス。 慎重に両側またはペレットを掻き取ることなく、2分を吸引上清のための3400 RCFで遠心分離します。 100％の氷冷アセトンを用いて、3.10 – 手順に3.9を繰り返します。 空気の流れを伴うまたはバキュとドライペレットええと、または単に開いたチューブを残すことによって遠心します。アセトンは急速に蒸発します。 完全白色層を溶解することが可能で、最小容量でのddH 2 O（蒸留水）とヒストンを溶解します。ヒストンは、水に容易に溶解します。 1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブ内のペレットを100μlのddH 2 Oの場合は、通常、ヒストンを収集するのに十分です。 2分間3400 RCFで遠心分離し、上清を新しいチューブに移します。 タンパク質濃度および純度の4推定タンパク質濃度を測定するため、BCA、Bradfordタンパク質アッセイまたはアミノ酸分析（AAA）を使用します。ヒストンは、芳香族アミノ酸残基に劣っているように、280nmの吸光度を採用して技術を使用しないでください。 15％アクリルアミドゲル及びクマシー染色（オプション）とのSDS-PAGE分析によって抽出されたヒストンの純度を確認してください。 高純度の単一ヒストン変異体が望ましい場合、のHPLC-UV分画に進みヒストンバリアント（第5節）。ない場合は、ボトムアップヒストンPTM解析（セクシ​​ョン6）のための準備をサンプリングするために直接進んでください。 逆相HPLCによるヒストンバリアントの5.分離（オプション） 注：高純度ヒストン変異体は、UV検出器に結合された逆相HPLCを用いて粗ヒストン混合物を分画することにより得ることができます。これらの精製されたヒストンは、より高い感度と純度を必要とする研究に有用です。分析は十分な感度と網羅あるのでしかし、標準的なヒストンPTMの特徴付けのために、このステップをスキップすることができます。出発物質の300μgの – 無傷のヒストンの分別は、理想的には少なくとも100を必要とする変異体です。 、約100μgヒストンのと0.2ミリリットル/分の流速で2.1ミリメートル×250 mmカラムを使用します。：開始ヒストン濃度に応じてHPLCに適切なC 185μmのカラムを接続します約300μgのヒストンと、で4.6×250 mmカラムを使用0.8ミリリットル/分の流速。次のように専用のガラス器具を使用して、緩衝液AとBを準備します。 HPLCグレードの水に5％のHPLCグレードのアセトニトリル、0.1％TFA：緩衝液Aを準備します。 HPLC等級の水で95％、HPLCグレードのアセトニトリル、0.1％TFA：緩衝液Bを準備します。 UV検出器にカラムを接続し、210に吸光度を設定 – 220 nmの。 0.1-1％TFAの最終濃度を達成するために、100％TFAを含む水に溶解したヒストンサンプルを酸性化。 3カラム体積にほぼ相当推奨流量、少なくとも15分間は100％緩衝液Aでカラムを平衡化します。 UV検出器のゼロ吸光度レベルを設定するには、この信号を使用します。 手動または自動サンプルコレクターで分画を収集するために適切なサイズのチューブを準備します。 約1μgの/μlの以上の濃度でサンプルを注入します。より大量に溶解したサンプルは、列デュの平衡を変化させる可能性があります下保持するリングロードとリード。 勾配を実行し、次のようにプログラムされた：1分で0〜30％のB、90分で30〜60％のB、1分で60〜90％Bから。 自動フラクションコレクターを使用して、1分間隔で（例えば、クロマトグラムを図2に示す）の画分を収集します。ボリューム全体を含むように適切なサイズのチューブ内の画分を収集します。 真空濃縮器で分画したサンプルを下に乾燥させます。 注：中間停止点：乾燥ヒストン画分短い期間室温で貯蔵することができる – 長期期間（1~2日）または-80℃の冷凍庫です。 ボトムアップ分析のための無水プロピオン酸を用いたヒストンの6化学誘導体化 50mMのNH 4 HCO 3の40μlのヒストンサンプルを溶解し、pHを8.0（推奨量：50から100μgの）。サンプルは純粋なのddH 2 Oであった場合は、50 mMの、pHが8を構成するために濃NH 4 HCO 3を追加します。0。 サンプルの損失なしpH指示薬ストリップを用いてpHをチェックするために試料中にP10ピペットチップを濡らします。 NH 4 OHとギ酸を8.0にpHを調整するために使用することができます。 注：プロトコル（6.3ステップ – 6.7）の以下の部分は、反応性無水プロピオン酸を維持するために、最大3〜4のサンプルのバッチで行われるべきです。 プロピオン酸無水物が使用され、後続のステップのためのドラフトチャンバーを使用してください。比1アセトニトリルと無水プロピオン酸を混合することによって新鮮プロピオニル試薬を調製する：3（v / v）です。 1でサンプリングするプロピオニル試薬を加える：4（v / v）です。 40μlのヒストンは、10μlのプロピオニル試薬を追加します。 注：このステップで白色破片を観察することが可能です。しかし、これはほとんどの塩およびプロピオン酸を含み、従って、特定のアクションが取られる必要はありません。 迅速にソリューションを再確立pHを8.0にNH 4 OHを追加します。注：ペプチドの遊離アミンと反応プロピオン酸無水物は、小道具を生成pH値を低下させるイオン酸。通常、1の比でサンプルにNH 4 OHを加える：5（v / v）の再確立pHを8.0に適切であり、 例えば、サンプルを40μlのNH 4 OHの8μlの。 ボルテックスですぐに混ぜます。 ステップ6.2と同様の手順を用いてpHを確認してください。 注意：pHが10.0よりも大きい場合に、より高いpKaを有する他のアミノ酸残基の標識が可能です。 室温で15分間サンプルをインキュベートします。 厳密プロピオニル試薬のバッチ当たりなし以上3以下または4のサンプルについて反応を行う、6.7 – 手順6.3を繰り返します。 真空濃縮器で20μlの – 10までドライサンプル。これはNH 4 OHから遊離の未反応無水プロピオン酸、アセトニトリル、酢酸とアンモニアガスを蒸発させます。サンプルが完全に乾燥した場合、有意なサンプル損失が生じません。 注：イソプロパノールの代わりにアセトニトリルを使用することができます。しかしながら、アセトニトリルは、より低い表面張力を有し、従って、より多くの急速な蒸発。 最終容量40μlのが達成されるまでのddH 2 Oでサンプルを再懸濁または希釈します。 6.9 – 手順6.2を繰り返します。ヒストンプロピオニルの二重丸は、反応完了の> 95％を保証します。 瓶中の水分と接触した酢酸の形成を防止するために、アルゴンガスとプロピオン酸無水物のボトルを充填します。 注：中間停止点：サンプルのddH 2 Oまたは乾燥中に再構成し-80℃で保存することができます。 トリプシン7.タンパク質分解消化 50mMのNH 4 HCO 3で再懸濁し、ヒストンを、1μg/μlの以上の最適濃度を達成します。より希釈された試料は、トリプシンの効率を低下させるために導きます。 注：この段階でヒストンは、それはまだ酸性、その後、ピペットチップを使用してサンプリングするために、NH 4 HCO 3、塩を追加した場合はpH8.0であることが必要です。 1:10（重量/重量）でヒストンサンプルにトリプシンを追加します。 Incuba8時間 – 6 37℃でTE。 -80℃で凍結することによって消化を停止します。 真空濃縮器で20μlの – 10にサンプルをドライダウン。 注：中間停止ポイント：サンプルを-80℃で保存することができます。 N末端でのヒストンペプチドの8プロピオニル注：このセクションでは、トリプシン消化物から生成されたN末端ペプチドの誘導体化を説明しています。プロピオニル基は、ペプチドの疎水性を増加させるように、 -そのような手順は、（ヒストンH3の8 例えば、アミノ酸3）最短のペプチドのHPLC保持を改善します。 100mMのNH 4 HCO 330μlの再懸濁サンプル。 6.9 – 手順6.1を繰り返します。 注：真空中のサンプルの乾燥は、この段階で時間がかかるのが普通です。 再懸 ​​濁または50でサンプルを希釈- 100μlののddH 2 O + 0.1％TFAまたは0.5％酢酸のいずれかすること。注意：酢酸は長い間ストレージのために推奨され、TFA facilitatとして長期的にはメチオニン酸化をES。 TFAは、より良いクロマトグラフィー保持を支援するようにステージ転倒（セクション9）は、同じ日に行われる一方、TFAをお勧めします。 注：中間停止ポイント：サンプルを-80℃で保存することができます。 ステージ-ヒント9.サンプル・脱塩注：この段階では、試料中に存在する塩があります。それらは、エレクトロの間にイオン化するため、塩は、ペプチドからの信号を抑制し、HPLC-MS分析を妨げます。塩はまた、非付加ペプチドに対する信号強度を低下させる、ペプチドのイオン性付加物を形成することができます。付加ペプチドは異なる質量を持つことになりますように、ペプチドは、適切に識別または定量化されることはありません。 P1000のピペットチップを用いて、固相抽出ディスクからC 18の材料のディスクパンチ。溶融シリカキャピラリーを使用してP1000チップの外にミニディスクを押してP100 / 200ピペットチップの底にミニディスクを堆積させます。 Dていることを確認してくださいISKを確実に先端部（ 図3）の底部に押し込まれます。 注：P1000の先端がC 18のディスクをパンチするために、むしろ小さな穴があります。より大きな直径の穴を有するために、先端の最後のセンチを切断することが適切です。 サンプルの25μgの上で脱塩ならば、同じP100 / P200チップ内の2つのC 18のパンチを使用してください。 1.5ミリリットルまたは2ミリリットルマイクロ遠心チューブ内の所定の位置にステージのヒントを保持するために遠心アダプターを使用してください。 ; – （400 RCF 300）の回転が遅いを使用します溶媒は、通常、1分も経たないうちに樹脂を通過します。 C 18材料を活性化し、潜在的な汚染を除去するために、100％アセトニトリル50μlの紡糸することによって、樹脂をフラッシュします。 低速遠心分離によって0.1％TFAの80μLをフラッシュすることによってディスクを平衡化します。 pHが4.0または酢酸で下にサンプルを酸性化。サンプルの損失を最小限にするためのpHストリップでpHを確認してください。低速遠心分離することにより、ディスク上にロードしたサンプル。 ウォッシュ低速遠心分離によって0.1％TFA80μlの – 70を洗い流すことにより、サンプル。 低速遠心分離によって70μlの75％アセトニトリルおよび0.5％酢酸をフラッシュすることによって試料を溶出します。 1.5mlチューブ内のサンプルを収集します。 真空濃縮器で乾燥したサンプル。 注：中間停止ポイント：サンプルを-80℃で保存することができます。 ヒストンペプチドの10解析注：従来のペプチド分析で行われるようにNLC-MSプラットフォームを設定する必要があります。 200の使用-彼らは感度と安定性との間に良好な妥協点であるとして300 nlのフローカラム（内径75μm分析カラム、C 18粒子）が、推奨されます。 MS取得方法は、ターゲットを絞ったスキャン19またはデータに依存しないアクイジション（DIA）20,21、代表的な結果と、図4で説明したの両方でデータ依存取得（DDA）の組み合わせのいずれかであることができます。 HPLCバッファを準備 – A：0.1％ギ酸でHPLCグレードの水; B：HPLCグレードのアセトニトリル中0.1％ギ酸。 0から30％緩衝液Bへの30分間で、30から次の5分間100％Bにし、8分間のアイソクラチック100％Bで次のようにHPLC法をプログラムします。 10分間の0％Bで1分およびイソクラティックフローの100％から0％のBの勾配：HPLCは試料装填する前に自動化されたカラム平衡化のためにプログラムされていない場合は、以下のものを含みます。 300 NL /分 – 250に解析の流量を設定します。 プログラムのターゲットを絞ったスキャン19またはDIA 20,21（ 図4）と組み合わせるDDAのいずれかを実行するには、MS取得方法。 MSのデューティ・サイクルは、より正確な定量を可能にする、クロマトグラフピークを横切るに十分なデータポイントを持つために、1の完全なMSは毎〜2秒をスキャンできることを確認してください。注：C 18クロマトグラフィーにより、平均ベースライン、ピーク幅は、上述した勾配は約30秒です。 負荷HPLC C上に試料約1μgのolumn。 プログラムされたようにHPLC-MS / MS法を実行します。 注：個々のプロテオミクス研究室が開発した任意の最適なセットアップが方法のために適しているであろうようなプロトコルでは、列、MS機器やMSパラメータの詳細の詳細をお勧めしません。ヒストンペプチドは従来のペプチドとして分離するのでプロテオミクス研究所は、その最適化された設定を使用する必要があります。 11.データ解析ピーク面積積分を実行するためのソフトウェアにMS RAWファイルをインポートします。注：EpiProfile 22が推奨され、それがヒストンペプチド用に最適化されています。クロマトグラフィーの溶出の保持時間の知識を使って、既知のヒストンペプチドの信頼性のあるピーク領域抽出を行います。また、スカイライン23は、目的のために別の理想的なソフトウェアです。 その修飾された形態の全てにおいて、そのペプチドの全面積で、その領域を分割し、所定のペプチドの相対量を計算します。注：ディスカバリーANALYの場合sisのマスコットは、修正されたヒストンペプチドのスペクトルを識別することをお勧めします。このツールの性能は、最近24に記載されています。プロテオミクスのための他のすべてのデータベースの検索エンジンも使用可能であるが、我々のテスト時に、彼らは低いパフォーマンスを提供しました。