El aislamiento del gigante lampbrush cromosomas de estar ovocitos de ranas y salamandras
Summary
Presentamos técnicas simples para aislar cromosomas gigantes lampbrush transcripcionalmente activas a partir de ovocitos de ranas y salamandras que viven. Se describe cómo observar estos cromosomas "vivo" por contraste de fase o contraste diferencial de interferencia, y la forma de solucionarlos por hibridación fluorescente in situ o tinción de inmunofluorescencia.
Abstract
Se describen métodos para el estudio de los cromosomas gigantes transcripcionalmente activos lampbrush (LBC) que se encuentran en el ovocito, o el huevo unlaid, de ranas y salamandras. LBC individuales pueden ser de hasta 1 mm de longitud y de que residan en un núcleo gigante, en sí hasta 0,5 mm de diámetro. El gran tamaño de los cromosomas permite observaciones sin precedentes de genes activos por microscopía óptica de luz, pero al mismo tiempo se requieren técnicas especiales para aislar el núcleo, la eliminación de la envoltura nuclear, y la difusión de los cromosomas en un portaobjetos de microscopio. El núcleo de los ovocitos, también llamada la vesícula germinal (GV), se aísla en un medio que permite la gelificación parcial de la actina nuclear y preserva la delicada estructura de las LBC. Este paso se lleva a cabo manualmente bajo un microscopio de disección utilizando pinzas de joyero. A continuación, se retira la envoltura nuclear, de nuevo manualmente con unas pinzas de joyero. Los contenidos nucleares se transfieren rápidamente a un medio que disperses el gel de actina y permite a los LBC en buen estado a asientan sobre un portaobjetos de microscopio. En este punto, los LBC y otros orgánulos nucleares pueden ser vistos por contraste de fase o de interferencia diferencial microscopía de contraste, aunque los detalles más finos están oscurecidos por el movimiento browniano. Para la observación microscópica alta resolución o el análisis molecular, toda la preparación se centrifugó para unir las LBC delicados firmemente a la diapositiva. Una breve fijación en paraformaldehído es seguido por la tinción de inmunofluorescencia o hibridación in situ. LBC están en un estado transcripcionalmente activo y su enorme tamaño permite el análisis molecular a nivel de genes individuales usando microscopía confocal o de super-resolución.
Introduction
La mayoría de los vertebrados, con la notable excepción de los marsupiales y mamíferos placentarios, producen huevos grandes con yema. A pesar de su enorme tamaño a veces, estos huevos son células individuales que llegan a su dimensión final, mientras que aún en el ovario de la hembra. Los huevos de ovario se denominan ovocitos y cada normalmente contiene un solo núcleo gigante, conocido desde principios del siglo 19 como la vesícula germinal o simplemente GV. 1 Los ovocitos de las ranas de laboratorio comunes, Xenopus laevis y Xenopus tropicalis, alcanzan un diámetro máximo de 1,2 mm y 0,8 mm, respectivamente (Figura 1). Los GVs de ovocitos maduros de estas dos ranas son 0,3 – 0,4 mm de diámetro (Figuras 2, 3). Salamandras suelen tener ovocitos y Planos generales aún mayores. Ovocitos completamente maduros del ajolote mexicano, Ambystoma mexicanum, son más de 2 mm de diámetro y de la GV es de unos 0,5 mm. Por lo tanto, estos núcleos son fácilmente visibles a simple vista y Canser manipulada de muchas maneras que son imposibles con los núcleos de células somáticas típicas.
Igualmente notable es el tamaño gigantesco de los cromosomas dentro de la GV, un hecho ya reconocido al final del siglo 19. Cromosomas individuales de Ambystoma y otros salamandras pueden ser de hasta 1 mm de longitud (Figuras 4, 5). Aquellos de Xenopus son considerable más pequeño, aunque con longitudes de hasta 100 micras o más, se empequeñecen los cromosomas somáticos típicas de la mayoría de los organismos. Una característica importante de los cromosomas de ovocitos es su extraordinaria actividad transcripcional, lo que conduce a uno de sus rasgos más característicos morfológicos – cientos de bucles laterales pareadas (Figura 5). Cada bucle consta de una o unas pocas unidades de transcripción que sintetizan activamente ARN. Los bucles dan ovocito cromosomas un aspecto borroso, lo que llevó al nombre del cromosoma "lampbrush" después de su superficialparecido con los pinceles utilizados en épocas anteriores para limpiar las chimeneas de la lámpara de queroseno. 2
El objetivo de este trabajo es sobre el uso de Planos generales aislados para estudiar LBC y orgánulos nucleares (nucleolos, los órganos de la histona locus, y manchas). se describen dos técnicas muy diferentes. En la primera técnica, más común, GVs están aislados en una solución salina utilizando pinzas de joyero, se enjuagó brevemente para eliminar la yema de adherente, y se retira la envoltura nuclear, de nuevo con unas pinzas de joyero. El contenido gelatinoso, que contienen los LBC y orgánulos nucleares, se les permite asentarse sobre un portaobjetos de vidrio o cubreobjetos. Tales preparaciones pueden ser examinados directamente por contraste de fases o microscopía DIC. Alternativamente, las preparaciones pueden ser centrifugadas para unir las LBC y orgánulos a la diapositiva o cubreobjetos. Tales preparaciones se pueden procesar para el análisis molecular detallado de ácidos nucleicos y proteínas, principalmente por inmunofluorescencia y fluorescent hibridación in situ (FISH). 3-7
Una segunda técnica consiste en el aislamiento de la GV en aceite mineral. 8 Planos generales en aceite aislado permanecen transcripcionalmente activo durante muchas horas y son potencialmente útiles para estudios en los que se quieren los contenidos nucleares sean lo más realista posible. 9,10 Debido a que el índice de refracción de la "savia" nuclear es cercana a la de los LBC y otros orgánulos nucleares (Figura 3), técnicas microscópicas puede ser un desafío con Planos generales de petróleo aislado.
Por último, debido a su tamaño y facilidad de manipulación, GVS material ideal para los estudios sobre la envoltura nuclear. El complejo del poro nuclear fue descrita por primera vez a partir de estudios de microscopía electrónica en sobres GV de anfibios y 11 observaciones más recientes superresolución haber utilizado el mismo material. 12,13
Protocol
Representative Results
Discussion
Las primeras observaciones de LBC "vivos" de Planos generales aislado a mano de ranas y salamandras se hicieron hace casi 80 años por el biólogo estadounidense William Duryee, 19 antes de la introducción de contraste de fases y microscopía DIC, antes de la inmunotinción fluorescente, y antes de FISH. Las ventajas de LBC para investigar los detalles de la estructura cromosómica y la transcripción en el desarrollo necesario nivel de genes individuales de técnicas para la fijación del LBC a po…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research reported in this publication was supported by the National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health under award number R01 GM33397. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health. J.G.G. is American Cancer Society Professor of Developmental Genetics.
Materials
| Paraformaldehyde (reagent grade, crystalline) | Sigma-Aldrich | P6148-500G | Despite warnings in many protocols, a concentrated solution can be stored indefinitely at room temperature |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | A5040-100G | Sometimes referred to as MS-222 |
| Ethicon RB-1 1/2 circle taper point 3-0 sutures | VWR | 95057-000 | |
| Paraplast (paraffin wax) | Sigma-Aldrich | P3558-1KG | |
| p-Phenylenediamine | Sigma-Aldrich | P6001 | |
| Gelatin | Grocery Store | Commercial Knox gelatin works fine | |
| ProLong Gold antifade mountant | ThermoFisher Scientific | P10144 | |
| Gold Seal cover glass 22 x 22 mm #1 1/2 (0.16-0.19 mm thick) | Electron Microscopy Sciences | 63786-01 | These coverslips are the recommended thickness for superresolution microscopy |
| Dumont forceps #5 | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_positive_action.aspx |
| Paraffin oil (light) | EMD Chemicals | PX0047-1 | For isolating GVs in oil |
| Adhesive in situ PCR and hybridization chambers (25 µl). | BioRad | Frame-Seal Slide Chambers #SLF0201 | http://www.bio-rad.com/en-us/sku/slf0201-frame-seal-slide-chambers |
| Silicone isolators | Grace-Biolabs | select from catalog link | http://www.gracebio.com/life-science-products/microfluidics/silicone-isolators.html |
| Coplin jars and staining dishes | Electron Microscopy Sciences | select from catalog link | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/histology/staining.aspx |
References
- Purkinje, J. E. . Symbolae ad ovi avium historiam ante incubationem. , (1830).
- Rückert, J. E. Zur Entwickelungsgeschichte des Ovarialeies bei Selachiern. Anat. Anz. 7, 107-158 (1892).
- Callan, H. G. . Lampbrush Chromosomes. 36, (1986).
- Gall, J. G., Callan, H. G., Wu, Z., Murphy, C., Kay, B. K., Peng, H. B. Lampbrush chromosomes. Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Vol. 36 Methods in Cell Biology , 149-166 (1991).
- Gall, J. G., Wu, Z. Examining the contents of isolated Xenopus germinal vesicles. Methods. 51, 45-51 (2010).
- Penrad-Mobayed, M., Kanhoush, R., Perrin, C. Tips and tricks for preparing lampbrush chromosome spreads from Xenopus tropicalis oocytes. Methods. 51, 37-44 (2010).
- Morgan, G. T. Working with oocyte nuclei: cytological preparations of active chromatin and nuclear bodies from amphibian germinal vesicles. Methods Mol. Biol. 463, 55-66 (2008).
- Paine, P. L., Johnson, M. E., Lau, Y. T., Tluczek, L. J., Miller, D. S. The oocyte nucleus isolated in oil retains in vivo structure and functions. Biotechniques. 13, 238-246 (1992).
- Handwerger, K. E., Cordero, J. A., Gall, J. G. Cajal bodies, nucleoli, and speckles in the Xenopus oocyte nucleus have a low-density, sponge-like structure. Mol Biol Cell. 16, 202-211 (2005).
- Patel, S., Novikova, N., Beenders, B., Austin, C., Bellini, M. Live images of RNA polymerase II transcription units. Chromosome Res. 16, 223-232 (2008).
- Gall, J. G. Octagonal nuclear pores. J Cell Biol. 32, 391-399 (1967).
- Löschberger, A., et al. Super-resolution imaging visualizes the eightfold symmetry of gp210 proteins around the nuclear pore complex and resolves the central channel with nanometer resolution. J Cell Sci. 125, 570-575 (2012).
- Gottfert, F., et al. Coaligned dual-channel STED nanoscopy and molecular diffusion analysis at 20 nm resolution. Biophys J. 105, L01-L03 (2013).
- Wallace, R. A., Jared, D. W., Dumont, J. N., Sega, M. W. Protein incorporation by isolated amphibian oocytes: III. Optimum incubation conditions. J. Exp. Zool. 184, 321-333 (1973).
- Bridger, J., Spector, D. L., Goldman, R. D., Leinwand, L. A. Fluorescence in situhybridization to DNA. Cells: A Laboratory Manual. 3, 111.111-111.136 (1998).
- Singer, R. H., Spector, D. L., Goldman, R. D., Leinwand, L. A. In situ hybridization to RNA. Cells: A Laboratory Manual. 3, 111-116 (1998).
- Gardner, E. J., Nizami, Z. F., Talbot, C. C., Gall, J. G. Stable intronic sequence RNA (sisRNA), a new class of noncoding RNA from the oocyte nucleus of Xenopus tropicalis. Genes Dev. 26, 2550-2559 (2012).
- Talhouarne, G. J., Gall, J. G. Lariat intronic RNAs in the cytoplasm of Xenopus tropicalis oocytes. RNA. 20, 1476-1487 (2014).
- Duryee, W. R. Isolation of nuclei and non-mitotic chromosome pairs from frog eggs. Arch. Exp. Zellforsch. 19, 171-176 (1937).
