カエルとサンショウウオのリビング卵母細胞からジャイアントランプブラシ染色体の分離
Summary
私たちは、カエルやサンショウウオの卵母細胞を生きているから巨大な転写活性ランプブラシ染色体を単離するための簡単なテクニックを紹介します。私たちは、位相コントラストまたは微分干渉コントラスト、およびどのようにin situハイブリダイゼーションまたは免疫蛍光染色における蛍光のためにそれらを修正することにより、「生きている」これらの染色体を観察する方法について説明します。
Abstract
私たちは、カエルやサンショウウオの卵母細胞、または埋葬されていない卵、で見つかった巨大な転写活性ランプブラシ染色体（のLBCs）を研究するための方法が記載されています。最大直径0.5mmに、自身の個々のLBCsの長さは、最大1ミリメートルとすることができ、彼らは巨大な核内に存在します。染色体のサイズが大きい光光学顕微鏡による活性遺伝子の比類のない観測を可能にするが、同時に、特別な技術は、核の単離核エンベロープを除去し、顕微鏡スライド上に染色体を拡散するために必要とされます。また、卵核胞（GV）と呼ばれる卵母細胞の核は、核アクチンの部分的なゲル化を可能にし、のLBCsの繊細な構造を保存媒体に隔離されています。このステップは、宝石商の鉗子を使用して、解剖顕微鏡下で手動で行われます。次に、核膜は、宝石商の鉗子で再び手動で削除されます。核内容はすぐにdispe媒体に転写されていますアクチンゲルRSESと損傷していないのLBCsは、顕微鏡スライド上に決済することができます。細かい詳細はブラウン運動によって隠されているが、この時点でのLBCs及び他の核小器官は、位相コントラストまたは微分干渉コントラスト顕微鏡で観察することができます。高解像度の顕微鏡観察や分子分析のために、製剤全体がスライドにしっかりと繊細なのLBCsを添付するために遠心分離されます。パラホルムアルデヒド中で簡単に固定が、その後免疫蛍光染色によって、またはin situハイブリダイゼーションに続いています。 LBCsは、転写活性状態にあり、それらの巨大なサイズは、共焦点又は超解像顕微鏡を使用して、個々の遺伝子レベルでの分子の分析を可能にします。
Introduction
ほとんどの脊椎動物は、有袋類および胎盤哺乳類の注目すべき例外を除いて、大規模な卵黄のような卵を産みます。その時々巨大なサイズにもかかわらず、これらの卵はまだ女性の卵巣ながら、最終寸法に達する単一細胞です。卵巣卵は卵母細胞と呼ばれ、それぞれは、典型的には、単に胚胞またはGV早ければ19 世紀から知られている単一の巨大な核を、含まれています。一般的な実験のカエル、 アフリカツメガエルやアフリカツメガエルトロピカの1卵母細胞は、それぞれ1.2ミリメートルと0.8ミリメートルの最大直径（ 図1）に達します。直径0.4ミリメートル（ 図2、図3） -これら2カエルの成熟卵母細胞からのGVは0.3です。サンショウウオは、典型的には、さらに大きく卵母細胞とのGVを持っています。メキシコアホロートル、Ambystomaのmexicanumの完全に成熟卵母細胞は、直径2 mm以上であり、GVは約0.5mmです。したがって、これらの核は、肉眼や缶に容易に表示されます典型的な体細胞の核では不可能であり、多くの方法で操作すること。
同様に顕著GV内の染色体の巨大なサイズ、19 世紀の終わりに既に認識された事実です。 Ambystomaおよび他のサンショウウオの個々の染色体の長さは最大1ミリメートル（ 図4、図5）とすることができます。 100μm以上までの長さで、彼らはほとんどの生物の典型的な体細胞の染色体を矮星が、 アフリカツメガエルのものは、小さいかなりあります。対の横方向のループの数百（ 図5） -卵母細胞染色体の重要な特徴は、それらの最も特徴的な形態学的特徴の一つにつながり、それらの異常な転写活性です。各ループは積極的にRNAを合成する1つまたは少数の転写単位から構成されています。ループは、卵母細胞は、その表面的な後に名前 "ランプブラシ"染色体につながったファジーな外観を、染色体与えます灯油ランプの煙突をきれいにするために、以前の回で使用したブラシに似ています。 2
この論文の焦点はのLBCs及び核細胞小器官（核小体、ヒストン遺伝子座体、およびスペックルを）勉強する孤立のGVの使用にあります。二つかなり異なる技術について説明します。まず、より一般的な技術では、のGVを簡単接着卵黄を除去するためにリンス、宝石商の鉗子を使用して、食塩水で単離される、および核膜を宝石商の鉗子で再び除去されます。 LBCsと核細胞小器官を含むゲル状の内容は、顕微鏡スライドガラスまたはカバーガラス上に定着させています。このような製剤は、位相コントラストやDIC顕微鏡によって直接調べることができます。また、調製物は、スライドまたはカバースリップにのLBCsや細胞小器官を添付するために遠心分離することができます。このような調製物は、その後、主に免疫蛍光及びfluorescenによって、核酸およびタンパク質の詳細な分子分析のために処理することができますin situハイブリダイゼーション（FISH） における T。 3-7
第2の技術は、鉱油中のGVの単離を含みます。 8オイル分離されたのGVは、多くの時間のための転写活性のままで、もう1つは核の内容は、できるだけ実物そっくりになりたいと思っている研究に有用である可能性があります。 9,10核「樹液」の屈折率はのLBCsと他の核内小器官（ 図3）に近いので、顕微鏡の技術は、油分離されたのGVと挑戦することができます。
最後に、それらの大きさや操作のしやすさの、のGVは核膜の研究のための理想的な材料です。核膜孔複合体は、最初の両生類のGVエンベロープ11とより最近の超解像観察に電子顕微鏡研究から説明したのと同じ材料を使用しています。 12,13
Protocol
Representative Results
Discussion
カエルやサンショウウオの手孤立のGVから「生きている」のLBCsの最初の観測は、蛍光免疫染色の前に、およびFISHの前に、アメリカの生物学者ウィリアム・Duryee、位相コントラストやDIC顕微鏡の導入前の19で、ほぼ80年前に作られました。リアルな方法でそれらを修正するために、その基本的な形態を破壊することなく、分子技術を適用するために、ガラススライドにのLBCsを取り付け?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research reported in this publication was supported by the National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health under award number R01 GM33397. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health. J.G.G. is American Cancer Society Professor of Developmental Genetics.
Materials
| Paraformaldehyde (reagent grade, crystalline) | Sigma-Aldrich | P6148-500G | Despite warnings in many protocols, a concentrated solution can be stored indefinitely at room temperature |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | A5040-100G | Sometimes referred to as MS-222 |
| Ethicon RB-1 1/2 circle taper point 3-0 sutures | VWR | 95057-000 | |
| Paraplast (paraffin wax) | Sigma-Aldrich | P3558-1KG | |
| p-Phenylenediamine | Sigma-Aldrich | P6001 | |
| Gelatin | Grocery Store | Commercial Knox gelatin works fine | |
| ProLong Gold antifade mountant | ThermoFisher Scientific | P10144 | |
| Gold Seal cover glass 22 x 22 mm #1 1/2 (0.16-0.19 mm thick) | Electron Microscopy Sciences | 63786-01 | These coverslips are the recommended thickness for superresolution microscopy |
| Dumont forceps #5 | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_positive_action.aspx |
| Paraffin oil (light) | EMD Chemicals | PX0047-1 | For isolating GVs in oil |
| Adhesive in situ PCR and hybridization chambers (25 µl). | BioRad | Frame-Seal Slide Chambers #SLF0201 | http://www.bio-rad.com/en-us/sku/slf0201-frame-seal-slide-chambers |
| Silicone isolators | Grace-Biolabs | select from catalog link | http://www.gracebio.com/life-science-products/microfluidics/silicone-isolators.html |
| Coplin jars and staining dishes | Electron Microscopy Sciences | select from catalog link | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/histology/staining.aspx |
References
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