Isolement du géant lampbrush Chromosomes de Living oocytes de grenouilles et salamandres
Summary
Nous présentons des techniques simples pour isoler géants chromosomes plumeux transcriptionnellement actifs à partir d'ovocytes de grenouilles et de salamandres vivant. Nous décrivons comment observer ces chromosomes "vivant" par contraste de phase ou de contraste d' interférence différentiel, et comment les fixer pour hybridation in situ fluorescente ou immunofluorescence dans.
Abstract
Nous décrivons des méthodes pour étudier les chromosomes géants transcriptionnellement actifs plumeux (LBC) trouvés dans l'ovocyte, ou l'oeuf unlaid, des grenouilles et des salamandres. LBC individuels peuvent être jusqu'à 1 mm de longueur et ils résident dans un noyau gigantesque, se jusqu'à 0,5 mm de diamètre. La grande taille des chromosomes permet des observations sans précédent de gènes actifs par microscopie optique à lumière, mais en même temps, des techniques spéciales sont nécessaires pour isoler le noyau, en enlevant l'enveloppe nucléaire, et la propagation des chromosomes sur une lame de microscope. Le noyau de l'ovocyte, également appelé la vésicule germinale (GV) est isolé dans un milieu qui permet une gélification partielle de l'actine nucléaire et préserve la structure délicate des LBC. Cette étape est réalisée manuellement sous un microscope à dissection à l'aide des pinces de bijoutier. Ensuite, l'enveloppe nucléaire est retirée, à nouveau manuellement à l'aide des pinces de bijoutier. Les matières nucléaires sont rapidement transférés vers un milieu dispeÉSA le gel d'actine et permet aux LBC intactes pour régler sur une lame de microscope. À ce stade, les LBC et autres organites nucléaires peuvent être consultés par contraste de phase ou de contraste d'interférence différentiel microscopie, bien que les détails plus fins sont obscurcis par le mouvement brownien. Pour l'observation de résolution microscopique élevée ou l'analyse moléculaire, l'ensemble de la préparation est centrifugée pour attacher les LBC délicates fermement à la diapositive. Une brève fixation dans paraformaldéhyde est ensuite suivie par immunofluorescence ou par hybridation in situ. LBC sont dans un état transcriptionnellement actif et de leur taille énorme permet une analyse moléculaire au niveau du gène individuel utilisant confocale ou nanoscope.
Introduction
La plupart des vertébrés, à l'exception notable des marsupiaux et des mammifères placentaires, produisent de gros œufs yolky. En dépit de leur taille énorme, parfois, ces œufs sont des cellules uniques qui atteignent leur dimension finale tout en restant dans l'ovaire de la femelle. Oeufs ovariens sont appelés ovocytes et contiennent généralement un seul noyau géant, connu depuis le début du 19 e siècle comme la vésicule germinale ou simplement GV. 1 Ovocytes des grenouilles de laboratoire communes, Xenopus laevis et Xenopus tropicalis, atteignent un diamètre maximal de 1,2 mm et 0,8 mm respectivement (figure 1). GVS de ovocytes matures de ces deux grenouilles sont de 0,3 – 0,4 mm de diamètre (figures 2, 3). Salamandres ont généralement ovocytes et GV encore plus. Ovocytes entièrement matures de l'axolotl mexicain, Ambystoma mexicanum, sont plus de 2 mm de diamètre et la GV est d' environ 0,5 mm. Ainsi, ces noyaux sont facilement visibles à l'oeil nu et peutmanipuler de nombreuses manières qui sont impossibles avec les noyaux de cellules somatiques typiques.
Tout aussi remarquable est la taille gigantesque des chromosomes au sein de la GV, un fait déjà reconnu à la fin du 19 ème siècle. Chromosomes individuels de Ambystoma et d' autres salamandres peuvent être jusqu'à 1 mm de longueur (figures 4, 5). Ceux de Xenopus sont considérables plus petit, mais avec des longueurs allant jusqu'à 100 um ou plus, ils éclipsent les chromosomes somatiques typiques de la plupart des organismes. Une caractéristique importante de chromosomes ovocyte est leur activité transcriptionnelle extraordinaire, ce qui conduit à l' un de leurs plus caractéristiques morphologiques caractéristiques – des centaines de boucles latérales appariées (figure 5). Chaque boucle est constituée d'une ou de quelques unités de transcription qui synthétisent activement l'ARN. Les boucles donnent ovocyte chromosomes une apparence floue, ce qui a conduit au nom "lampbrush" chromosome après leur superficielleressemblance avec les pinceaux utilisés dans les premiers temps de nettoyer les cheminées de lampes au kérosène. 2
L'objectif de cet article est sur l'utilisation de GV isolées pour étudier et LBC organites nucléaires (nucléoles, les organismes de locus histone et mouchetures). Deux techniques assez différentes seront décrites. Dans la première technique, plus commune, GV sont isolés dans une solution saline à l'aide des pinces de bijoutier, brièvement rincé pour éliminer le jaune adhérent, et l'enveloppe nucléaire est retiré, encore une fois avec une pince de bijoutier. Le contenu gélatineux, contenant les LBC et des organites nucléaires, peuvent se déposer sur une lame de microscope en verre ou lamelle. Ces préparations peuvent être examinées directement par contraste de phase ou microscopie DIC. Alternativement, les préparations peuvent être centrifugés pour fixer les LBC et organites à la diapositive ou lamelle. De telles préparations peuvent ensuite être traitées pour une analyse moléculaire détaillée des acides nucléiques et de protéines, principalement par immunofluorescence et fluorescent hybridation in situ (FISH). 3-7
Une seconde technique implique l'isolement du GV dans de l'huile minérale. 8 GV de pétrole isolé restent transcriptionnellement actif pendant de nombreuses heures et sont potentiellement utiles pour les études où l' on veut le contenu nucléaires soient aussi réalistes que possible. 9,10 Parce que l'indice de réfraction de la "sève" nucléaire est proche de celle des LBC et autres organites nucléaires (figure 3), les techniques microscopiques peut être un défi avec GV de pétrole isolé.
Enfin, en raison de leur taille et leur facilité de manipulation, GVS matériau idéal pour des études sur l'enveloppe nucléaire. Le complexe du pore nucléaire a été décrite à partir études au microscope électronique sur des enveloppes GV amphibien 11 et des observations plus récentes SuperResolution ont utilisé le même matériau. 12,13
Protocol
Representative Results
Discussion
Les premières observations de LBC "de vie" de GV isolé main de grenouilles et de salamandres ont été faites il y a près de 80 ans par le biologiste américain William Duryee, 19 avant l'introduction de contraste de phase et microscopie DIC, avant immunomarquage fluorescent, et avant FISH. Les avantages de la LBC pour enquêter sur les détails de la structure des chromosomes et la transcription au niveau du gène individuel développement nécessaire des techniques pour fixer les LBC lames …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research reported in this publication was supported by the National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health under award number R01 GM33397. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health. J.G.G. is American Cancer Society Professor of Developmental Genetics.
Materials
| Paraformaldehyde (reagent grade, crystalline) | Sigma-Aldrich | P6148-500G | Despite warnings in many protocols, a concentrated solution can be stored indefinitely at room temperature |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | A5040-100G | Sometimes referred to as MS-222 |
| Ethicon RB-1 1/2 circle taper point 3-0 sutures | VWR | 95057-000 | |
| Paraplast (paraffin wax) | Sigma-Aldrich | P3558-1KG | |
| p-Phenylenediamine | Sigma-Aldrich | P6001 | |
| Gelatin | Grocery Store | Commercial Knox gelatin works fine | |
| ProLong Gold antifade mountant | ThermoFisher Scientific | P10144 | |
| Gold Seal cover glass 22 x 22 mm #1 1/2 (0.16-0.19 mm thick) | Electron Microscopy Sciences | 63786-01 | These coverslips are the recommended thickness for superresolution microscopy |
| Dumont forceps #5 | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_positive_action.aspx |
| Paraffin oil (light) | EMD Chemicals | PX0047-1 | For isolating GVs in oil |
| Adhesive in situ PCR and hybridization chambers (25 µl). | BioRad | Frame-Seal Slide Chambers #SLF0201 | http://www.bio-rad.com/en-us/sku/slf0201-frame-seal-slide-chambers |
| Silicone isolators | Grace-Biolabs | select from catalog link | http://www.gracebio.com/life-science-products/microfluidics/silicone-isolators.html |
| Coplin jars and staining dishes | Electron Microscopy Sciences | select from catalog link | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/histology/staining.aspx |
References
- Purkinje, J. E. . Symbolae ad ovi avium historiam ante incubationem. , (1830).
- Rückert, J. E. Zur Entwickelungsgeschichte des Ovarialeies bei Selachiern. Anat. Anz. 7, 107-158 (1892).
- Callan, H. G. . Lampbrush Chromosomes. 36, (1986).
- Gall, J. G., Callan, H. G., Wu, Z., Murphy, C., Kay, B. K., Peng, H. B. Lampbrush chromosomes. Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Vol. 36 Methods in Cell Biology , 149-166 (1991).
- Gall, J. G., Wu, Z. Examining the contents of isolated Xenopus germinal vesicles. Methods. 51, 45-51 (2010).
- Penrad-Mobayed, M., Kanhoush, R., Perrin, C. Tips and tricks for preparing lampbrush chromosome spreads from Xenopus tropicalis oocytes. Methods. 51, 37-44 (2010).
- Morgan, G. T. Working with oocyte nuclei: cytological preparations of active chromatin and nuclear bodies from amphibian germinal vesicles. Methods Mol. Biol. 463, 55-66 (2008).
- Paine, P. L., Johnson, M. E., Lau, Y. T., Tluczek, L. J., Miller, D. S. The oocyte nucleus isolated in oil retains in vivo structure and functions. Biotechniques. 13, 238-246 (1992).
- Handwerger, K. E., Cordero, J. A., Gall, J. G. Cajal bodies, nucleoli, and speckles in the Xenopus oocyte nucleus have a low-density, sponge-like structure. Mol Biol Cell. 16, 202-211 (2005).
- Patel, S., Novikova, N., Beenders, B., Austin, C., Bellini, M. Live images of RNA polymerase II transcription units. Chromosome Res. 16, 223-232 (2008).
- Gall, J. G. Octagonal nuclear pores. J Cell Biol. 32, 391-399 (1967).
- Löschberger, A., et al. Super-resolution imaging visualizes the eightfold symmetry of gp210 proteins around the nuclear pore complex and resolves the central channel with nanometer resolution. J Cell Sci. 125, 570-575 (2012).
- Gottfert, F., et al. Coaligned dual-channel STED nanoscopy and molecular diffusion analysis at 20 nm resolution. Biophys J. 105, L01-L03 (2013).
- Wallace, R. A., Jared, D. W., Dumont, J. N., Sega, M. W. Protein incorporation by isolated amphibian oocytes: III. Optimum incubation conditions. J. Exp. Zool. 184, 321-333 (1973).
- Bridger, J., Spector, D. L., Goldman, R. D., Leinwand, L. A. Fluorescence in situhybridization to DNA. Cells: A Laboratory Manual. 3, 111.111-111.136 (1998).
- Singer, R. H., Spector, D. L., Goldman, R. D., Leinwand, L. A. In situ hybridization to RNA. Cells: A Laboratory Manual. 3, 111-116 (1998).
- Gardner, E. J., Nizami, Z. F., Talbot, C. C., Gall, J. G. Stable intronic sequence RNA (sisRNA), a new class of noncoding RNA from the oocyte nucleus of Xenopus tropicalis. Genes Dev. 26, 2550-2559 (2012).
- Talhouarne, G. J., Gall, J. G. Lariat intronic RNAs in the cytoplasm of Xenopus tropicalis oocytes. RNA. 20, 1476-1487 (2014).
- Duryee, W. R. Isolation of nuclei and non-mitotic chromosome pairs from frog eggs. Arch. Exp. Zellforsch. 19, 171-176 (1937).
