الحمض النووي الريبي في وقت واحد استخراج من الرواسب الساحلية والكمي ل16S الجينات الريباسي والنصوص التي في الوقت الحقيقي PCR
Summary
A protocol to quantify bacterial 16S rRNA genes and transcripts from coastal sediments via real-time PCR is provided. The methodology includes the co-extraction of DNA and RNA; preparation of DNA-free RNA; and 16S rRNA gene and transcript quantification via RT-q-PCR, including standard curve construction.
Abstract
في الوقت الحقيقي تفاعل البلمرة المتسلسل المعروف أيضا باسم PCR الكمي (ف-PCR) هو أداة تستخدم على نطاق واسع في البيئة الميكروبية لتحديد الكميات المتوفرة من الجينات في مجموعات تصنيفية وظيفية في العينات البيئية. تستخدم بالاقتران مع الناسخ رد الفعل العكسي (RT-ف-PCR)، فإنه يمكن أيضا أن تستخدم لتحديد النصوص الجينات. Q-PCR يجعل من استخدام حساسة للغاية كيمياء كشف الفلورسنت التي تسمح الكمي من amplicons PCR خلال المرحلة الأسية من رد الفعل. لذلك، يتم تجنب التحيز المرتبطة "نقطة النهاية" PCR في الكشف عن المرحلة هضبة تفاعل PCR. بروتوكول لقياس الجينات 16S الريباسي البكتيرية والنصوص من الرواسب الساحلية عبر في الوقت الحقيقي يتم توفير PCR. لأول مرة، وهي طريقة للرئيسين استخراج الحمض النووي والحمض النووي الريبي من الرواسب الساحلية، بما في ذلك الخطوات الإضافية اللازمة لإعداد رنا خالية من الحمض النووي، ويرد. ثانيا، دليل خطوة بخطوة لتقدير حجم الجينات 16S الريباسي والنقويرد anscripts من الأحماض النووية المستخرجة عبر Q-PCR و RT-ف-PCR. هذا يتضمن تفاصيل لبناء الحمض النووي والحمض النووي الريبي مستوى المنحنيات. تدرج الاعتبارات الأساسية لاستخدام فحوصات RT-ف-PCR في البيئة الميكروبية.
Introduction
الكائنات الدقيقة هي حجر الزاوية وظيفة المحيط الحيوي القيادة النظام البيئي. لا تزال غالبية الكائنات الحية الدقيقة جاهل 1. لذلك النهج الجزيئية أساس أساسية لتعميق فهمنا للتنوع وظيفة من الكائنات الحية الدقيقة في البيئة. الوسطى إلى هذه الأساليب هو استخراج الأحماض النووية من العينات البيئية والتضخيم لاحق من الجينات المستهدفة باستخدام تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR).
وتهدف الخطوة الأولى لاستخراج DNA / RNA إلى ليز جدران الخلايا من الجراثيم الحاضر المجتمع، وإزالة جزيئات نوكليك حمض غير غير مرغوب فيها (المواد على سبيل المثال، العضوية وغير العضوية) والاحتفاظ DNA / RNA في حل لمزيد من التحليل المصب. من بين العديد من الخيارات المتاحة في الأدب 2،3،4،5، بما في ذلك مجموعة من مجموعات استخراج التجارية، وطريقة غريفيث 6 واستخدمت على نطاق واسع 7،8،9. فمن فعالة من حيث التكلفة والسلطة الفلسطينيةrticularly مناسبة تماما لالرواسب كما أنه يستخدم خطوة بفوزه على حبة لليز الخلايا ويتضمن خطوات للحد من شارك في استخراج مثبطات PCR، مثل الأحماض الدبالية، بينما يتعافى في وقت واحد DNA و RNA.
يستخدم الخطوة الثانية في تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) لتضخيم الجينات المستهدفة، مثل علامة التصنيفية 16S الريباسي، من الأحماض النووية المستخرجة. هذا النهج لديه ويستمر لتسهيل استكشاف uncharacterized الميكروبي 10،11 الصندوق الأسود. ومع ذلك، وأساليب نقطة النهاية PCR القائم تعاني من القيود المختلفة التي يمكن التحيز توصيف المجتمعات الميكروبية 12. لتحديد بدقة وفرة جين / نسخة، في الوقت الحقيقي PCR، المعروف أيضا باسم PCR الكمي (QPCR) يجب أن تستخدم. QPCR يستغل أنظمة صبغ مراسل الفلورسنت التي تتبع تراكم amplicon بعد كل دورة من PCR. وهذا أمر مهم لأنه يعني أنه يمكن أن يحدث الكمي خلال المرحلة الأسي في وقت مبكر، بدلامن نقطة النهاية، مرحلة رد الفعل PCR، عندما العائد amplicon لا يزال يتناسب طرديا مع وفرة الأولى من الجين المستهدف.
تستخدم نظامين مراسل عادة: والإقحام الحمض النووي وصمة عار 13 و 5 النشاط '3' نوكلياز خارجية من الحمض النووي بوليميريز 14. منذ النظام السابق مراسل يربط indistinctively لجميع الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل، فإنه قد يؤدي إلى المبالغة في تقدير تسلسل الهدف إذا amplicons غير محددة غير المرغوب فيها أو dimers التمهيدي من المنتجات تحدث. من أجل الالتفاف على هذا، قد تكون هناك حاجة تطويري مكثف من التضخيم. في النظام الأخير، يتم تعقب قالب التضخيم باستخدام مزيج من النشاط 5 "نوكلياز من البلمرة طق أن يشق على fluorophore من التحقيق الداخلي. هذه الميزة تزيد من خصوصية الفحص بسبب استخدام مسبار الفلورة الذي يربط فقط على التكميلية sequenc هدف محددالبريد بين الزوج التمهيدي. مع كل كيمياء يتحقق الكمي من خلال تحديد نقطة عبور (حزب المحافظين) حيث تراكم amplicons PCR، مقاسا زيادة في مضان، هو أعلى بكثير مضان الخلفية.
وقد استخدم QPCR نطاق واسع في البيئة الميكروبية لتحديد الكميات المتوفرة من الجينات في بيئات مختلفة 15. وعلاوة على ذلك، يتم الجمع بين النسخ العكسي من الحمض النووي الريبي إلى [كدنا مع QPCR وRT-QPCR لقياس التعبير الجيني. وبالتالي، QPCR وRT-QPCR تمثل وطرق سريعة فعالة لتقدير أعداد الجينات و / أو نص في العينات البيئية.
الكائنات الدقيقة في رسوبيات الساحلية بالسيارة عمليات النظم الإيكولوجية المختلفة، بما في ذلك تمعدن من المواد العضوية، وتدهور الملوثات والدراجات البيولوجية الكيميائية من المواد الغذائية الرئيسية مثل 16،17،18 النيتروجين. فهم شامل لهذه التحولات يتطلب محاسبات شاملر من المساهمة السكان الميكروبية، بما في ذلك البيانات الكمية عن الجين ونسخة فرة. ونقدم لك هنا مجموعة من البروتوكولات اختبارها بدقة، مبسطة وموحدة لتقدير حجم البكتيرية الجين ونسخة فرة 16S الريباسي في الرواسب الساحلية. يحدد البروتوكول جمع العينات، الحمض النووي في وقت واحد واستخراج الحمض النووي الريبي، وإعداد رنا خالية من الحمض النووي، وفحص الجودة من الأحماض النووية المستخرجة، وتوليد 16S الريباسي الحمض النووي والمعايير -RNA النوعي والكمي للعينات البيئية. وهناك حاجة إلى البيانات الكمية المستمدة من الأساليب المذكورة هنا لتسليط الضوء على المجتمعات الميكروبية القيادة النظم الإيكولوجية الساحلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
مزيج من الحمض النووي استخراج / RNA مع QPCR يوفر، طريقة فعالة نسبيا من حيث التكلفة سريعة ودقيقة لتقدير حساسية من الجين ونسخة فرة من مجموعة من العينات البيئية، مثل الرواسب الساحلية.
استخراج الحمض النووي الأولي هو خطوة حاسمة لضمان عرض تمثيلي من الجراثيم الحاضر المجتمع ويتحقق 22. تحتاج إلى النظر فيها لبروتوكول استخراج عدد من القيود: أ) تحقيق إجمالي تحلل الخلية، ب) المشارك استخراج المركبات المثبطة (على سبيل المثال، الأحماض الدبالية أو polyphenolics)، ج) تلويث الحمض النووي في جزء RNA، د) تدهور السريع في الأحماض النووية المستخرجة عند تخزينها. يجب اتخاذ الاحتياطات اللازمة من أجل الالتفاف على هذه القيود. على سبيل المثال، عناية خاصة لابد من اتخاذها لضمان استخلاص الأحماض النووية هو الأمثل لنوع العينة (على سبيل المثال، الرسوبيات والتربة ومياه الصرف الصحي، الخ). تحسينات كبيرة في العائد الحمض النووي والجودة لكل من الحمض النووي والحمض النووي الريبي لا يمكن أن يتحقق من خلال تنفيذ التجارب الأولية 23. للحد من تأثير المركبات المثبطة على التطبيقات القائمة على PCR-24، واختبار مجموعة من التخفيفات من الحمض النووي المستخرج والحمض النووي الريبي. للالتفاف على التدهور السريع في استخراج الحمض النووي / الحمض النووي الريبي من عدة دورات تجميد ذوبان الجليد وتجنب الخسارة المحتملة للمعلومات الوراثية، وتخزين متعددة قسامات صغيرة الحجم في -80 درجة مئوية.
عندما صممت بعناية، QPCR هو وسيلة قوية، تكرار للغاية وحساسة. والجدير بالذكر أن وسائل لتضخيم وبناء منحنى القياسية المبينة في هذا البروتوكول يمكن تكييفها لأي هدف الجينات في المصالح، بما في ذلك علامات أخرى النشوء والتطور (أي archaeal 16S الريباسي، الفطرية 18S الريباسي) أو الجينات المسؤولة عن وظائف مهمة في البيئة. قيود المعروفة في استخدام QPCR هي: أ) توليد استنساخه عالية الجودة الصورةمنحنى tandard لتقدير المطلق، ب) اختيار التمهيدي / تحقيقات وتعظيم الاستفادة من الظروف فحص ف-PCR، ج) استخدام منخفضة الجودة / المنفصمة الأحماض النووية، د) اختيار التخفيف عمل DNA / RNA لتجنب تثبيط . وعلاوة على ذلك، فإنه لابد من النظر أن QPCR تقنية توفر الكميات المتوفرة من الجينات / نسخة التي قد لا تساوي الخلية تهم: هذا هو الحال بصفة خاصة عندما يتم استهداف الجينات 16S و 18S الريباسي، والكائنات الحية الدقيقة ديها أعداد نسخة مختلفة من الجينات الريباسي في جيناتهم 25.
سوف الفقيرة منحنيات معايير الجودة يؤدي إلى تقدير دقيق من الجينات في المصالح. ومن الممارسات الجيدة لتخزين مخزون من معايير عالية التركيز في قسامات صغيرة يمكن من خلالها جعل منحنيات معيار جديدة. لا تخزن المنحنيات القياسية، ودائما التخفيفات جديدة من الأسهم إلى أعلى تركيز في كل مرة. لتقدير دقيق للعينات البيئية ضمان مجموعة من تركيزات ستانمنحنى المعيارية يمتد القيم حزب المحافظين المتوقعة من العينات غير معروف. عندما قياس النصوص، بناء منحنى قياسي من الحمض النووي الريبي لا مضاعفة الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل. عندما يكون ذلك ممكنا، يجب أن تكتمل الكمي للعينات لمقارنة مباشرة في فحص واحد لتجنب بين فحص التباين 20. قد لا يكون هذا ممكنا دائما. لذلك، لمقارنة الكميات المتوفرة من الجينات المولدة بين المقايسات فإنه من المستحسن أن يكون عشوائي مجموعة فرعية من عينات النسخ المتماثل بين المقايسات. تشكيلة واسعة من التمهيدي والتحقيق مجموعات متاحة للQPCR تستهدف الأنواع الميكروبية والمجموعات الوظيفية وهناك حاجة 15. دراسة متأنية عند اختيار هذه لضمان كل من التغطية القصوى وخصوصية للمجموعة المستهدفة حاليا. اذا كانت كفاءة رد فعل من فحص QPCR ليست مرضية، ويبدأ استكشاف الأخطاء وإصلاحها مع اختبار مختلف الظروف الدراجات الحرارية (كما زمنية الصلب و / أو درجة الحرارة) و / أو ظروف التفاعل، على سبيل المثال، تركيزات التمهيدي مسبار متفاوتة. Oالامتحانات التنافسية الوطنية هي الأمثل للمقايسة ورد فعل الظروف ف-PCR، دائما إجراء اختبار أولي لمجموعة من التخفيفات DNA / كدنا] لتحديد تركيز القالب المناسب. حدد نطاق التخفيف مما أدى إلى أكبر عدد نسخة في التخفيف القالب الأمثل لمزيد من الفحوص.
حاليا، تقنيات التسلسل الجيل المقبل من تسليط الضوء على كفاءة بنية المجتمع الميكروبي وظائف في عدد كبير من البيئات 26،27،28. ومع ذلك، غالبا ما تقوم هذه المجموعات على نقطة النهاية المكتبات amplicon PCR، وبالتالي لا توفر سوى تقديرات شبه الكمية من وفرة الأنواع معين. وبالتالي، فإن القدرة في الوقت الحقيقي تقنية PCR القائم لاستهداف علامات تصنيفية معينة (من مجال العالي وصولا الى مستوى سلالة) يسمح التحقق من صحة الفعال للنتائج التي حصل عليها الجيل المقبل من التسلسل. وعلاوة على ذلك، تم استخدام QPCR بنجاح في تركيبة مع البيئة الميكروبية أساليب أخرى الجزيئية مثل ايزو مستقرتوب التحقيق (SIP) أو المجهرية النشوء والتطور / وظيفية. جنبا إلى جنب مع أداة السابقة، QPCR يمكن استخدامها لقياس مجتمع نشط أيضي 29،30. عندما جنبا إلى جنب مع تحليل ميكروأري، يوفر QPCR التفسير الكمي الرئيسي من المسوح علامة والجينات الوظيفية النشوء والتطور من بيئات 31،32.
لذلك، سواء كان استخدامها وحدها أو بالاشتراك مع (غالبا على أساس عملية) التقييمات الأخرى من وظيفة النظام الإيكولوجي، الكمي PCR هو أداة أساسية لعلماء البيئة الميكروبية في استكشاف ارتباط بعيد المنال بين المجتمعات الميكروبية وظائف النظم الإيكولوجية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد انبثقت هذه النشرة من الأبحاث التي أجريت بدعم مالي من مجلس بحوث البيئة الطبيعية (NERC) تحت رقم منحة NERC NE / JO11959 / 1 و العلوم أيرلندا مؤسسة وللعمل COFUND ماري كوري تحت رقم جرانت 11 / SIRG / B2159awarded إلى CJS والأكاديمية اتحاد البحوث الشرقية (شرق ARC).
Materials
| Diethylpyrocarbonate | Sigma | 40718 | Toxic, open under chemical hood |
| cetrimonium bromide (CTAB) | Sigma | 52365 | Irritant, open under chemical hood |
| potassium phosphate dibasic | Sigma | RES20765 | |
| potassium phosphate monobasic | Sigma | P9791 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamylalcohol pH 8 | Sigma | P2069 | Equilibrate at pH 8 before using |
| Chloroform:Isoamylalcohol | Sigma | 25666 | |
| sodium chloride | VWR | 1.06404.0500 | |
| polyethylenglycol 6000 | VWR | 528877-100 | |
| Ethanol Molecular Grade | Sigma | E7148 | |
| Lysing Matrix E tubes | MP Biomedical | 116914050 | |
| Turbo DNAse | Ambion | AM1907 | |
| Taq polymerase | Sigma | D1806 | |
| dNTPs | Bioline | BIO-39028 | |
| SuperScript III | Life Technologies | 18080044 | |
| Rnase Inhibitor | Life Technologies | 10777019 | |
| RNAse/DNAse free 0.2 ml PCR tubes | Sarstedt | 72.985.002 | |
| SureCleanPlus | Bioline | BIO-37047 | |
| pGEM Easy T Vector | Promega | A1360 | |
| E. coli JM109 competent cells | Promega | L2005 | |
| Tryptone | Sigma | T7293 | |
| Yeast Extract | Sigma | 70161 | |
| Ampicillin | Sigma | 59349 | |
| X-Gal | Bioline | BIO-37035 | |
| IPTG | Bioline | BIO-37036 | |
| Agar | VWR | 20768.235 | |
| Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
| Qubit | Life Technologies | Q33216 | |
| Quant-IT DNA HS Assay | Life Technologies | Q-33120 | |
| Quant-IT RNA HS Assay | Life Technologies | Q32855 | |
| MEGAshortscript kit | Ambion | AM1354 | |
| TaqMan SensiFast Probe Lo-ROX kit | Bioline | BIO-84002 | |
| qPCR machine |
References
- Epstein, S. S. The phenomenon of microbial uncultivability. Curr. Opin. Microbiol. 16 (5), 636-642 (2013).
- Zhou, J., Bruns, M. A., Tiedje, J. M. DNA recovery from soils of diverse composition. Appl. Environ. Microbiol. 62, 316-322 (1996).
- Miller, D. N., Bryant, J. E., Madsen, E. L., Ghiorse, W. C. Evaluation and optimization of DNA extraction and purification procedures from soil and sediments samples. Appl. Environ. Microbiol. 65 (11), 4715-4724 (1999).
- Burgmann, H., Pesaro, M., Widmer, F., Zeyer, J. A strategy for optimizing quality and quantity of DNA extracted from soil. J. Microbiol. Methods. 45 (1), 7-20 (2001).
- Hurt, R. A., et al. Simultaneous recovery of RNA and DNA from soils and sediments. Appl. Environ. Microbiol. 67, 4495-4503 (2001).
- Griffiths, R. I., Whiteley, A. S., O’Donnell, A. G., Bailey, M. J. Rapid method for coextraction of DNA and RNA from natural environments for analysis of ribosomal DNA- and rRNA-based microbial community composition. Appl. Environ. Microbiol. 66 (12), 5488-5491 (2000).
- Martins, G., et al. Structure and activity of lacustrine sediment bacteria involved in nutrient and iron cycles. FEMS Microbiol. Ecol. 77 (3), 666-679 (2011).
- Kuffner, M., et al. Effects of season and experimental warming on the bacterial community in a temperate mountain forest soil assessed by 16S rRNA gene pyrosequencing. FEMS Microbiol. Ecol. 82 (3), 551-562 (2011).
- Tatti, E., et al. Influences of over winter conditions on denitrification and nitrous oxide-producing microorganism abundance and structure in an agricultural soil amended with different nitrogen sources. Agric. Ecosyst . Environ. 183, 47-59 (2014).
- Giovannoni, S. J., Britschgi, T. B., Moyer, C. L., Field, K. G. Genetic diversity in the Sargasso Sea bacterioplankton. Nature. 345, 60-62 (1990).
- Ward, D. W., Weller, R., Bateson, M. M. 16S rRNA sequences reveal numerous uncultured microorganisms a natural community. Nature. 345, 63-65 (1990).
- Suzuki, M. T., Giovannoni, S. J. Bias caused by template annealing in the amplification of mixture of 16S rRNA genes by PCR. Appl. Environ. Microbiol. 62, 625-630 (1996).
- Wittwer, C. T., Herrmann, M. G., Moss, A. A., Rasmussen, R. P. Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification. Biotechniques. 22, 130-138 (1997).
- Holland, P. M., Abramson, R. D., Watson, R., Gelfand, D. H. Detection of Specific Polymerase Chain Reaction Product by Utilizing the 5′ 3′ Exonuclease Activity of Thermus aquaticus DNA Polymerase. PNAS. 88, 7276-7280 (1991).
- Smith, C. J., Osborn, A. M. Advantages and limitations of quantitative PCR (Q-PCR)-based approaches in microbial ecology. FEMS Microbiol. Ecol. 67, 2-20 (2009).
- Park, S. J., Park, B. J., Rhee, S. K. Comparative analysis of archaeal 16S rRNA and amoA genes to estimate the abundance and diversity of ammonia-oxidizing archaea in marine sediments. Extremphiles. 12 (4), (2008).
- Urakawa, H., Yoshida, T., Nishimura, M., Ohwada, K. Characterization of depth-related population variation in microbial communities of a coastal marine sediment using 16S rDNA-based approaches and quinone profiling. Environ. Microbiol. 2, 542-554 (2008).
- Smith, C. J., Dong, L. F., Wilson, J., Stott, A., Osborn, A. M., Nedwell, D. B. Seasonal variation in denitrification and dissimilatory nitrate reduction to ammonia process rates and corresponding key functional genes along an estuarine nitrate gradient. Front. Microbiol. 6, 542 (2015).
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular Cloning: a laboratory manual. , 205 (2001).
- Smith, C. J., Nedwell, D. B., Dong, L. F., Osborn, A. M. Evaluation of Quantitative Polymerase Chain Reaction (Q-PCR) based approaches for determining gene copy and gene transcript numbers in environmental samples. Environ. Microbiol. 8 (5), 804-815 (2006).
- Suzuki, M. T., Taylor, L. T. DeLong E.F., Quantitative analysis of small-subunit rRNA genes in mixed microbial population via 5′-nuclease assays. Appl. Environ. Microbiol. 66, 4605-4614 (2000).
- Luna, G. M., Dell’Anno, A., Danovaro, R. DNA extraction procedure: a critical issue for bacterial diversity assessment in marine sediments. Environ. Microbiol. 8 (2), 308-320 (2005).
- Lever, M. A., Torti, A., Eickenbursch, P., Michaud, A. B., Šantl-Temkiv, T., Jørgensen, B. B. A modular method for the extraction of DNA and RNA, and the separation of DNA pools from diverse environmental sample types. Front. Microbiol. 6, 476 (2015).
- Lloyd, K. G., MacGregor, B. J., Teske, A. Quantitative PCR methods for RNA and DNA in marine sediments: maximizing yield while overcoming inhibition. FEMS Microbol. Ecol. 72, 144-151 (2010).
- Klappenbach, J. A., Dumbar, J. M., Schmidt, T. M. rRNA Operon copy number reflects ecological strategies of bacteria. App. Environ. Microbiol. 66 (4), 1328-1333 (2000).
- Shi, Y., Tyson, G. W., Eppley, J. M., DeLong, E. F. Integrated metatrascriptomic and metagenomics analyses of stratified microbial assemblages in the open ocean. ISME J. 5, 999-1013 (2011).
- Howe, A. C., Jansson, J. K., Malfatti, S. A. Tringe S.G., Tiedje J.M., & Brown C.T. Tackling soil diversity with the assembly of large, complex metagenomes. PNAS. 111 (13), 4904-4909 (2014).
- Klaedtke, S., et al. Terroir is a key driver of seed-associated microbial assemblages. Environ. Microbiol. , (2015).
- Lueders, T., Wagner, B., Claus, P., Friedrich MW, . Stable isotope probing of rRNA and DNA reveals a dynamic methylotroph community and trophic interactions with fungi and protozoa in oxic rice field soil). Environ. Microbiol. 6, 60-72 (2004).
- Kunapuli, U., Lueders, T., Meckenstock, R. U. The use of stable isotope probing to identify key iron-reducing microorganisms involved in anaerobic benzene degradation. ISME J. 1, 643-653 (2007).
- Bürgmann, H., et al. Transcriptional response of Silicibacter pomeroyi DSS-3 to dimethylsulfoniopropionate (DMSP). Environ. Microbiol. 9 (11), 2742-2755 (2007).
- He, J. Z., et al. Geochip: a comprehensive microarray for investigating biogeochemical ecological and environmental processes. ISME J. 1, 67-77 (2007).
