Los ensayos in vitro de colonias para la caracterización de células progenitoras Tri-potentes Aislado de los murinos adultos Páncreas

El páncreas se compone de tres grandes linajes de células; Las células acinares segregan enzimas digestivas, conductos secretan mucina para defenderse de patógenos y el transporte de las enzimas digestivas en el intestino, y las células endocrinas secretan hormonas, como la insulina y el glucagón, que mantienen la homeostasis de la glucosa. Durante el desarrollo embrionario del páncreas, las células ductales primeros son la fuente de las células progenitoras tri-potente capaz de dar lugar a los tres linajes en el páncreas de animales adultos ^1,2. Dado que las células madre y progenitoras adultas, tales como células madre de médula ósea, ya se utilizan con éxito para el tratamiento de diversas enfermedades ^3, hay un gran interés en la búsqueda de las células madre y progenitoras en el páncreas adulto. Si el aislamiento y la manipulación de células madre y progenitoras pancreáticas adultas eran posibles, estas células podrían utilizarse para tratar enfermedades tales como la diabetes tipo 1, en el que las células secretoras de insulina se destruyen por autoinmunidad.

<p class = "jove_content"> si las células progenitoras tri-potente todavía existen en los conductos pancreáticos adultos después de la finalización del desarrollo embrionario es una cuestión que está muy debatido en la comunidad científica. En este debate, y el uso in vivo cre-lox linaje de trazado de técnicas, Inada y colaboradores demostraron que las células ductales murinos adultos marcados con un marcador, anhidrasa carbónica II, podrían dar lugar a los tres linajes pancreáticos ^4. Sin embargo, utilizando otros marcadores ductales, como HNF1B ⁵ y Sox9 ^2, se concluyó que las células ductales no son la principal fuente de las células beta en ratones adultos.

Hace varios años, hemos propuesto que la causa del mencionado debate puede ser debido a la falta, en el campo de ^6,7, de herramientas analíticas adecuadas que se pueden utilizar para medir la auto-renovación y multi-linaje de diferenciación y dos criterios necesarios para definir una célula madre. El vivo cre-lox técnica de trazado de linaje en el mencionadoanterior puede proporcionar evidencia de la relación progenitor-hijo en un nivel de población. Sin embargo, esta técnica de rastreo de linaje está limitada en su poder de discernir si las células progenitoras individuales pueden auto-renovarse y diferenciarse en múltiples linajes. El análisis de una sola célula es importante porque si varios progenitores mono-potente, cada uno con un potencial de linaje diferente, se analizaron en conjunto, pueden aparecer colectivamente tener capacidades de diferenciación de múltiples linajes. Además, las células madre son por lo general una población menor de un órgano adulto. Las actividades de una población de células de menor importancia podrían ser enmascarados por la importante población. Por lo tanto, un resultado negativo de un estudio de la población no indica necesariamente la ausencia de células madre. Por último, el trazado de cre-lox linaje actualmente no permiten la medición de auto-renovación.

Para empezar a solucionar la brecha técnica en el campo de la biología de células progenitoras de páncreas, colonia ^7-11 o ^12-15 organoid </suSe idearon p> ensayos que utilizan sistemas de cultivo en 3D. Dos ensayos de colonias de progenitores pancreáticos se han desarrollado en nuestro laboratorio: uno contiene una preparación comercial de proteínas murinas de la matriz extracelular (ECM) (ver Métodos y equipos de mesa), y el otro contiene hidrogel laminina, una proteína artificial ECM definido ^7-11. Las células progenitoras se mezclan en un medio semi-sólido que contiene metilcelulosa. Metilcelulosa es un material biológicamente inerte y viscoso preparado a partir de fibras de madera, y se ha utilizado de forma rutinaria en ensayos de colonias hematopoyéticas ^16. El medio semi-sólido que contiene metilcelulosa-restringe el movimiento de las células progenitoras individuales de manera que no pueden volver a agregado. Sin embargo, el medio es lo suficientemente suave para permitir que una célula progenitora para crecer y diferenciarse en una colonia de células en el espacio 3D. Siguiendo la tradición de los hematólogos, una célula progenitora pancreática que era capaz de dar lugar a una colonia de células era named una unidad formadora de colonias de páncreas (PCFU). PCFUs, cuando se cultiva en el ensayo de colonias que contiene ECM-murino, dan lugar a colonias quísticas que se denominan colonias "anillo" ^7. Tras la adición de un agonista de Wnt, R-spondin1, en ​​el cultivo que contiene ECM-murino, algunas colonias del anillo se convierten en colonias "densos" ^7. En este artículo, estos dos tipos de colonias crecidas en cultivo ECM murino se conocen colectivamente como "anillo colonias / densos". Cuando el anillo / Densas colonias se disocian en suspensión de células individuales y re-chapada en cultivos que contienen hidrogel laminina, colonias "Endocrino / acinares" se forman ^7.

El uso de una sola colonia de análisis, se encontró que la mayoría de las colonias Anillo / denso y Endocrino / acinares, ya sea de adultos (2-4 meses de edad) ^7,11 o jóvenes (1 semana de edad) ⁹ páncreas murino, expresan los tres marcadores de linaje. Esto sugiere que la mayoría de los PCFUs originarios se tri-potente. En el ensayo de colonias que contiene ECM-murino, adulto PCFUs murino robusta auto-renovarse y ampliar aproximadamente 500.000 veces más de 11 semanas en la cultura ^7. ECM murino preferentemente apoya la diferenciación de células ductales más de endocrinos y acinares linajes, mientras que en presencia de hidrogel laminina, se anima a PCFUs murinos para diferenciar preferentemente en células endocrinas y acinares y en menor medida con el linaje ductal ^7,9,11. Es importante destacar que, Insulina ⁺ Glucagon ^– células mono-hormonal se generan en la cultura de hidrogel laminina y secretan insulina en respuesta a la estimulación de glucosa in vitro ^7,9, lo que sugiere la madurez funcional. La diferenciación tri-linaje potencial ^7,9 y auto-renovación ¹¹ de PCFUs individuales son confirmados por micromanipulación de una sola célula, es decir, el cultivo de una célula por pocillo para la formación de colonias. En conjunto, estos resultados proporcionan evidencia de que hay auto-renovación, tri-potenT, células progenitoras-como en el páncreas murino posnatal que muestran actividades en cultivo 3D.

Los ensayos PCFU murinos descritos en este artículo se derivan de un ensayo de colonias antes diseñado para células progenitoras diferenciadas a partir de células madre embrionarias murinas (mESCs) ^17. Dicho protocolo se documenta en detalle en otra publicación JoVe ^18. Los componentes y las técnicas necesarias para llevar a cabo el ensayo de colonias que contiene ECM-murino para PCFUs adultos de cultivo son los mismos que para los progenitores derivados de mESC ^17,18. Por lo tanto, no se repetirán aquí estos aspectos del ensayo; en su lugar se abordarán los siguientes procedimientos: 1) la disociación del páncreas adulto y clasificación ⁺ células ductales CD133 ⁺ Sox9 / EGFP, que enriquecen PCFUs de ratones adultos ^7, 2) la manipulación de una sola célula de las células clasificadas, 3) de una sola colonia análisis utilizando microfluidos QRT-PCR y todo el montaje inmunotinción, y 4) la disociación de colonies en la suspensión de una sola célula y re-chapado en ECM murino o ensayos de colonias de hidrogel de laminina.