In Vitro Colony Os ensaios para a caracterização de células progenitoras Tri-potentes Isolado das adultas murino Pâncreas

O pâncreas é composto por três grandes linhagens celulares; células acinares secretam enzimas digestivas, dutos segregam mucina para se defender de agentes patogénicos e transportar enzimas digestivas para o intestino, e células endócrinas secretam hormônios, incluindo a insulina e glucagon, que mantêm a homeostase da glicose. Durante o desenvolvimento embrionário do pâncreas, as células ductais primeiros são a fonte das células progenitoras tri-potentes, capazes de dar origem às três linhagens no pâncreas dos animais adultos ^1,2. Como as células estaminais e progenitoras adultas, tais como células estaminais da medula óssea, são já utilizados com sucesso no tratamento de várias doenças ^3, existe grande interesse em encontrar as células estaminais e progenitoras no pâncreas adulto. Se o isolamento e manipulação de células estaminais e progenitoras adultas pancreáticos eram possíveis, estas células podem ser usadas para o tratamento de doenças tais como diabetes do tipo 1, em que as células secretoras de insulina são destruídas por auto-imunidade.

<p class = "jove_content"> Se as células progenitoras tri-potente ainda existem em ductos pancreáticos adultos após a conclusão do desenvolvimento embrionário é uma pergunta que é fortemente debatida na comunidade científica. Neste debate, e usando in vivo cre-lox-linhagem rastreamento técnicas, Inada e colaboradores mostraram que as células do ducto murino adulto marcadas com um marcador, anidrase carbônica II, poderia dar origem a todos os três linhagens pancreáticas ^4. No entanto, o uso de outros marcadores, tais como ductais HNF1B ⁵ e ² Sox9, concluiu-se que as células ductais não são a principal fonte de células beta em ratos adultos.

Vários anos atrás, foi proposto que a causa da discussão acima mencionado pode ser devido à falta, na área ^6,7, de ferramentas analíticas adequadas que podem ser utilizadas para medir a auto-renovação e multi-linhagem diferenciação dois critérios necessário definir uma célula estaminal. O vivo técnica de rastreamento de linhagem em cre-lox mencionadoacima pode fornecer evidência para a relação progenitor-descendência em um nível populacional. No entanto, esta técnica traçar a linhagem é limitado em seu poder para discernir se as células progenitoras individuais podem auto-renovar e diferenciar em várias linhagens. análise de uma única célula é importante porque se vários progenitores mono-potente, cada um com um potencial de linhagem diferente, foram analisados ​​em conjunto, eles podem aparecer em conjunto para ter capacidades de diferenciação multi-linhagem. Além disso, as células estaminais são normalmente uma população menor de um órgão adulto. As actividades de uma população de células menor pode ser mascarado pela maior população. Portanto, um resultado negativo de um estudo populacional não indica necessariamente a ausência de células-tronco. Finalmente, cre-lox linhagem rastreamento atualmente não permite a medição de auto-renovação.

Para começar a abordar a lacuna técnica no campo da biologia de células progenitoras do pâncreas, colônia ^7-11 ou ^12-15 organ�de </sup> ensaios utilizando sistemas de cultura 3D foram concebidos. Dois ensaios de colónias de progenitores pancreáticos foram desenvolvidos no nosso laboratório: uma contém uma preparação comercial de proteínas murinas da matriz extracelular (ECM) (ver Tabela Métodos e do equipamento), e o outro contém hidrogel laminina, uma proteína da MEC artificial definido ^7-11. As células progenitoras são misturados em meio semi-sólido contendo metilcelulose. A metilcelulose é um material biologicamente inerte e viscosa preparada a partir de fibras de madeira, e tem sido utilizada rotineiramente em ensaios de colónias hematopoiéticas ^16. O meio semi-sólido contendo metilcelulose-restringe o movimento das células progenitoras individuais de modo que não pode voltar a agregado. No entanto, a forma é suficientemente mole para permitir que uma célula progenitora para crescer e se diferenciam em células de uma colónia no espaço 3D. Seguindo a tradição dos hematologistas, uma célula progenitora pancreático que foi capaz de dar origem a uma colônia de células foi named uma unidade de formação de colónias do pâncreas (PCFU). PCFUs, quando cultivada no ensaio colónia contendo ECM murino, dão origem a colônias císticos que são nomeados "anel" colônias ^7. Após a adição de um agonista de Wnt, R-spondin1, na cultura contendo ECM murino, algumas colónias anel transformar em colónias "densas" ^7. Neste artigo, estes dois tipos de colônias crescidas em cultura ECM murino são colectivamente referidos como colônias "anel / densas". Quando anel / colônias densas são dissociados em suspensão única célula e re-banhado em culturas que contêm laminina hidrogel, colônias "Endocrine / acinares" são formadas ^7.

Usando única colônia análises, verificou-se que a maioria das colônias Anel / densas e Endócrino / acinares, quer a partir de adultos (2-4 meses de idade) ^7,11 ou jovens (1 semana de idade) ⁹ pâncreas murino, expressar todos os três marcadores de linhagem. Isto sugere que a maioria dos PCFUs originárias são tri-potente. No ensaio colónia contendo ECM murino, adulto PCFUs murino robustamente auto-renovar e expandir cerca de 500.000 vezes mais de 11 semanas em cultura ^7. ECM murino preferencialmente apoia a diferenciação de células ductais mais endócrinas e acinares linhagens, ao passo que na presença de hidrogel laminina, PCFUs murino são encorajados a diferenciar-se preferencialmente em células endócrinas e acinares e menos para a linhagem ductal ^7,9,11. Importante, Insulina Glucagon ^{+ –} células mono-hormonal são geradas na cultura hidrogel laminina e segregam insulina em resposta à glicose estimulação in vitro ^{de 7,9,} sugerindo a maturidade funcional. A diferenciação tri-linhagem potencial de ^7,9 e auto-renovação ¹¹ de PCFUs individuais são confirmados por micromanipulação de uma única célula, ou seja, a cultura de uma célula por poço para a formação de colónias. Juntos, estes resultados fornecem evidências de que há auto-renovação, tri-potent, células progenitoras-like no pâncreas murino pós-natal que mostram actividades na cultura 3D.

Os ensaios PCFU murino descritas neste artigo são derivados a partir de um ensaio de colónias antes concebido para células progenitoras diferenciadas a partir de células estaminais embrionárias de murídeo ⁽¹⁷⁾ mESCs. Esse protocolo está documentada em detalhes em outra publicação JoVE ^18. Os componentes e as técnicas necessárias para realizar o ensaio de colónias contendo ECM murino para adultos PCFUs cultura são os mesmos que para os progenitores derivados ^MESC-17,18. Portanto, estes aspectos do ensaio não será repetido aqui; em vez disso, ser dirigida os seguintes procedimentos: 1) dissociação do pâncreas adulto e triagem ⁺ células CD133 ⁺ Sox9 / EGFP ductais, que enriquecem PCFUs a partir de ratinhos adultos ^7, 2) manipulação de uma única célula das células separadas, 3) uma única colónia análises usando 4) dissociação do colonie microfluídico qRT-PCR e montagem-toda a imunocoloração, es em suspensão de uma única célula e re-plaqueamento em ECM murino ou laminina ensaios hidrogel colônia.