インビトロコロニーアッセイでトライ強力な前駆細胞を特徴付けるための大人のマウスの膵臓から分離されました

膵臓は、3つの主要な細胞系統で構成されています。腺房細胞が消化酵素を分泌する、ダクトは、病原体をかわすと腸に消化酵素を輸送するためにムチン分泌、および内分泌細胞は、グルコース恒常性を維持し、インスリンおよびグルカゴンなどのホルモンを、分泌します。膵臓の胚発生時には、初期の導管細胞は、成体動物^1,2の膵臓に3系統を生じることができるトライ強力な前駆細胞の源です。そのような骨髄幹細胞などの成体幹細胞および前駆細胞は、すでに正常に様々な疾患^3を治療するために使用されるので、成体膵臓幹細胞および前駆細胞を見つけることに強い関心があります。成体膵臓幹細胞および前駆細胞の単離および操作が可能であった場合は、これらの細胞は、インスリン分泌細胞は自己免疫によって破壊された1型糖尿病のような疾患を治療するために使用することができます。

<p clasS = "jove_content">トライ強力な前駆細胞がまだ胚発生完了後の成人膵管内に存在するかどうかは、多額の科学界で議論されている質問です。この議論では、およびin vivoでのcre-LOX系譜追跡技術を使用して、稲田と同僚は、マーカーで標識された大人のマウス膵管細胞、炭酸脱水酵素IIは、すべての3つの膵臓系統⁴を生じさせることができることを示しました。しかしながら、このようなHNF1b ⁵とのSox9 ²などの他の管のマーカーを使用して、それが管細胞は、成体マウスにおけるβ細胞の主な原因ではないと結論付けられました。

数年前、我々は、上記の議論の原因が必要な自己再生および多系列分化二つの基準に測定するために使用することができる適切な分析ツールで、フィールド^6,7において、欠如に起因し得ることを提案し幹細胞を定義します。上記のin vivoでのcre-LOXの系統追跡技術上記集団レベルでの前駆-子孫関係の証拠を提供することができます。しかし、この系統のトレース技術は、単一の前駆細胞は、自己再生し、複数の系統に分化することができるかどうかを識別するために、その電力が制限されます。いくつかのモノ強力な前駆細胞、異なる系統の電位のそれぞれが、一緒に分析した場合、それらをまとめて多系列分化能力を持っているように見える可能性があるため、単一細胞分析が重要です。さらに、幹細胞は、通常、成人器官の小集団です。マイナーな細胞集団の活動は、主要な人口でマスクすることができました。したがって、集団研究からの否定的な結果は、必ずしも、幹細胞が存在しないことを示すものではありません。最後に、CRE-LOXの系譜トレースは、現在、自己再生の測定を許可していません。

膵臓前駆細胞生物学、コロニーの分野で技術的なギャップに対処を開始するには^7-11またはオルガノイド^12月15日 </su三次元培養系を使用してP>アッセイを考案しました。膵臓前駆細胞のための二つのコロニーアッセイは、我々の研究室で開発された：1は、マウスの細胞外マトリックスタンパク質（ECM）（ 方法および装置表を参照）の市販の調製物が含まれ、もう一方はラミニンヒドロゲル、定義された人工的なECMタンパク質^7-11が含まれ^てい^ます 。前駆細胞は、メチルセルロースを含む半固形培地中で混合します。メチルセルロースは、木材繊維から調製し、生物学的に不活性粘性材料であり、日常的に、造血コロニーアッセイ¹⁶において使用されています。それらは再集合体をできないようにメチルセルロースを含む半固形培地は、単一の前駆細胞の移動を規制します。しかし、培地は、前駆細胞が増殖し、3次元空間における細胞のコロニーに分化させるのに十分柔らかいです。血液学者の伝統に従い、細胞のコロニーを生じさせることができた膵臓前駆細胞は、nでしたアメッド膵臓コロニー形成単位（P​​CFU）。ネズミECM-含むコロニーアッセイで増殖させた場合PCFUsは、「リング」コロニー⁷と命名されている嚢胞性コロニーを生じさせます。 Wntアゴニストを添加すると、R-spondin1は、マウスのECM含有培養に、いくつかのリングコロニーを「密」コロニー⁷に変わります。この記事では、マウスECM培養で生育したコロニーのこれらの2つのタイプをまとめて「リング/高密度」コロニーと呼ばれます。リング/高密度コロニーを単一細胞懸濁液に解離し、ラミニンヒドロゲルを含む培地に再播種するとき、「内分泌/腺房「コロニー^7が形成されています。

単一のコロニーを分析使用して^、9ネズミ膵臓、のいずれかから大人（2-4ヶ月齢^）7,11または若い（1週齢）リング/高密度および内分泌/腺房コロニーの大部分は、3つすべてを表現することが判明しました系統マーカー。これは、発信PCFUsのほとんどがトライ強力であることを示唆しています。ネズミECM-含むコロニーアッセイでは、大人のマウスPCFUsロバスト自己複製と文化⁷で11週間にわたって約50万回を展開します。ラミニンヒドロゲルの存在下で、ネズミPCFUsは内分泌および腺房細胞と腺管系統^7,9,11に非常に少ないに優先的に分化することが奨励されているのに対し、マウスECMは、優先的に、内分泌および腺房系統以上の管細胞の分化をサポートしています。重要なことは、インスリン⁺グルカゴン^–モノホルモンの細胞はラミニンヒドロゲル培養物中で生成され、機能的成熟を ​​示唆し、 インビトロ ^7,9 においてグルコース刺激に応答してインスリンを分泌しています。個々のPCFUsの三系列の分化ポテンシャル^7,9および自己再生^11は、コロニー形成のためにウェルあたり1細胞を培養すること、 すなわち 、単一細胞マイクロマニピュレーションによって確認されています。一緒に、これらの結果は、自己再生、トリpotenがあるという証拠を提供しますトン、3D培養における活性を示す生後マウスの膵臓内の前駆細胞様細胞。

この資料に記載されたマウスPCFUアッセイは、マウス胚性幹細胞（た^mESC）17から分化した前駆細胞のために設計された前コロニーアッセイに由来するものです。そのプロトコルは、別のJoveの出版物¹⁸に詳細に記載されています。培養成分及び成人PCFUs用マウスECM含有コロニーアッセイを行うために必要な技術は、MESC由来前駆^17,18と同じです。したがって、アッセイのこれらの側面は、ここでは繰り返さないことにします。代わりに、次の手順では、対処されることになります：1）成人の膵臓の解離および成体マウス^7、2）選別された細胞の単一細胞操作、3）シングルコロニーからPCFUsを豊かCD133 ⁺のSox9 / EGFP ⁺管細胞を、ソーティングマイクロ流体定量RT-PCRおよびホールマウント免疫染色を用いて分析し、コロニーの4）解離単一細胞懸濁液にsおよびマウスECMまたはラミニンヒドロゲルコロニーアッセイに再メッキ。