In Vitro Colony saggi per Caratterizzazione Tri-potenti cellule progenitrici isolato dal adulti murini Pancreas

Il pancreas è composto da tre principali linee cellulari; cellule acinose secernono enzimi digestivi, condotti secernere mucina per respingere gli agenti patogeni e il trasporto di enzimi digestivi per l'intestino e le cellule endocrine secernono ormoni, tra cui l'insulina e il glucagone, che mantengono l'omeostasi del glucosio. Durante lo sviluppo embrionale del pancreas, i primi cellule duttali sono la fonte delle cellule progenitrici tri-potenti in grado di dare origine a tre linee nel pancreas di animali adulti ^1,2. Poiché le cellule staminali e progenitrici adulte, come le cellule staminali del midollo osseo, sono già utilizzati con successo per il trattamento di varie malattie ^3, vi è intenso interesse nel trovare le cellule staminali e progenitrici nel pancreas adulto. Se l'isolamento e la manipolazione delle cellule staminali e progenitrici pancreatiche adulte erano possibili, queste cellule potrebbero essere utilizzate per il trattamento di malattie come il diabete di tipo 1, in cui le cellule che secernono insulina vengono distrutte da autoimmunità.

<p class = "jove_content"> Sia che ancora esistono cellule progenitrici tri-potenti in dotti pancreatici adulti dopo il completamento dello sviluppo embrionale è una domanda che è fortemente dibattuto nella comunità scientifica. In questo dibattito, e l'utilizzo in vivo cre-lox lineage tracing tecniche, Inada e colleghi hanno dimostrato che le cellule adulte duttale murine etichettati con un pennarello, carbonica II, potrebbero dare origine a tutte e tre le linee del pancreas ^4. Tuttavia, utilizzando altri marcatori duttali, come HNF1B era ⁵ e Sox9 ^2, si è concluso che le cellule duttali non sono la principale fonte di cellule beta topi adulti.

Molti anni fa, abbiamo proposto che la causa della discussione suddetto può essere dovuto alla mancanza, nel campo ^6,7, di strumenti analitici adeguati che possono essere utilizzati per misurare auto-rinnovamento e multi-lineage differenziazione-due criteri necessario definire una cellula staminale. L'in vivo cre-lox tecnica lineage tracing menzionatosopra può fornire prove per la relazione progenitore-progenie a livello di popolazione. Tuttavia, questa tecnica tracciando lignaggio è limitata nel suo potere di discernere se le cellule progenitrici singoli possono auto-rinnovarsi e di differenziarsi in molteplici linee. analisi singola cella è importante perché se diversi progenitori mono-potente, ognuno con un diverso potenziale stirpe, sono stati analizzati insieme, possono apparire collettivamente avere multi-lignaggio capacità di differenziazione. Inoltre, le cellule staminali sono di solito una frazione minore di un organo adulto. Le attività di una popolazione di cellule minore potrebbe essere mascherati dalla popolazione principale. Pertanto, un risultato negativo da uno studio di popolazione non indica necessariamente l'assenza di cellule staminali. Infine, cre-lox lignaggio tracciamento attualmente non consentono di misurare la auto-rinnovamento.

Per iniziare affrontando il divario tecnico nel campo della biologia delle cellule progenitrici del pancreas, colonia ^7-11 o ^12-15 organoide </sup> saggi che utilizzano sistemi di coltura 3D sono state elaborate. Due saggi di colonia per progenitori pancreatici sono stati sviluppati nel nostro laboratorio: uno contiene una preparazione commerciale di proteine ​​murine matrice extracellulare (ECM) (vedere Metodi e Impianti Table), e l'altra contiene idrogel laminina, un definito ECM proteina artificiale ^7-11. cellule progenitrici sono mescolati in mezzo semisolido contenente metilcellulosa. Metilcellulosa è un materiale biologicamente inerte e viscosa preparato da fibre di legno, ed è stato utilizzato di routine in saggi colonie ematopoietiche ^16. La metilcellulosa contenente mezzo semisolido limita il movimento delle cellule progenitrici singoli in modo che non può ri-aggregate. Tuttavia, il mezzo è abbastanza morbida da consentire una cellula progenitrice di crescere e differenziarsi in una colonia di cellule nello spazio 3D. Seguendo la tradizione degli ematologi, una cellula progenitrice del pancreas che è stato in grado di dare origine a una colonia di cellule era named una unità formanti colonie pancreatica (PCFU). PCFUs, quando coltivate nel saggio colonia ECM contenenti murino, danno origine a colonie cistica che sono denominati "Ring" colonie ^7. L 'aggiunta di un agonista Wnt, R-spondin1, nella cultura murino ECM-contenente, alcune colonie Anello trasformano in colonie "dense" ^7. In questo articolo, questi due tipi di colonie cresciute in coltura ECM murino sono indicate collettivamente come colonie "Ring / dense". Quando anello colonie / dense sono dissociate in sospensione di cellule singole e ri-placcato in culture che contengono laminina idrogel, colonie "Endocrine / acinari" si formano ^7.

Utilizzando singola colonia analisi, si è constatato che la maggior parte delle colonie Ring / densi e Endocrino / acinari, sia da adulto (2-4 mesi) ^7,11 o giovani (1 settimane di età) ⁹ pancreas di topo, esprimono tutti e tre marcatori lignaggio. Questo suggerisce che la maggior parte delle PCFUs originari sono tri-potenti. Nel saggio colonia ECM contenenti murino, adulto PCFUs murino robusta auto-rinnovarsi e di espandere di circa 500.000 volte più di 11 settimane nella cultura ^7. ECM murino supporta preferenzialmente la differenziazione delle cellule duttali oltre endocrine e acinose lignaggi, mentre in presenza di laminina idrogel, PCFUs murini sono incoraggiati a differenziarsi preferenzialmente in cellule endocrine e acinose e meno al duttale stirpe ^7,9,11. È importante sottolineare che, insulina ⁺ glucagone ^– celle mono-ormonale sono generati nella cultura idrogel laminina e secernere insulina in risposta al glucosio stimolazione in vitro ^7,9, suggerendo la maturità funzionale. La differenziazione tri-lignaggio potenziale ^7,9 e di auto-rinnovamento ¹¹ dei singoli PCFUs sono confermate da micromanipolazione cella singola, vale a dire, la coltura di una cella per bene per la formazione di colonie. Insieme, questi risultati forniscono la prova che ci sono auto-rinnovamento, tri-potent, cellule progenitrici simili nel pancreas murino postnatale che mostrano le attività in coltura 3D.

I saggi PCFU murini descritti in questo articolo sono derivati ​​da un test colonia prima progettata per le cellule progenitrici differenziate da cellule murine embrionali staminali (mESCs) ^17. Questo protocollo è documentato in dettaglio in un'altra pubblicazione JoVE ^18. I componenti e le tecniche necessarie per eseguire il test colonia ECM contenenti murino per PCFUs adulti cultura sono gli stessi di progenitori Mesc-derivati ^​​17,18. Pertanto, questi aspetti del test non saranno ripetute qui; invece saranno affrontate le seguenti procedure: 1) la dissociazione del pancreas adulti e ordinamento / EGFP ⁺ cellule duttali CD133 ⁺ SOX9, che arricchiscono PCFUs da topi adulti ^7, 2) la manipolazione cella singola delle cellule ordinati, 3) single-colonia analisi usando microfluidica qRT-PCR e tutto il montaggio immunostaining, e 4) la dissociazione di Colonies in cella singola sospensione e ri-placcatura in ECM murino o laminina saggi di idrogel colonia.