In - vitro - Assays für Colony Tri-potente Progenitorzellen Charakterisieren von den Adult Murine Pancreas Isoliert

Das Pankreas besteht aus drei Hauptzelllinien; acinar Zellen sezernieren Verdauungsenzyme, Kanäle Krankheitserreger abzuwehren und zu transportieren Verdauungsenzyme im Darm und endokrinen Zellen sezernieren Hormone, einschließlich Insulin und Glucagon, das Glukose-Homöostase aufrechtzuerhalten absondern Mucin. Während der embryonalen Entwicklung der Bauchspeicheldrüse, sind die frühen duktalen Zellen die Quelle der tri-potent Vorläuferzellen fähig ist , die zu den drei Linien in den Bauchspeicheldrüsen von erwachsenen Tieren ^1,2. Da adulten Stammzellen und Vorläuferzellen, wie Knochenmark – Stammzellen werden bereits erfolgreich verwendet , um verschiedene Krankheiten ^3, behandeln es intensive Interesse , die Stamm- und Vorläuferzellen im erwachsenen Bauchspeicheldrüse bei der Suche. Wenn die Isolierung und Manipulation von adulten Pankreas Stamm- und Vorläuferzellen möglich waren, konnten diese Zellen verwendet werden, um Krankheiten wie Typ-1-Diabetes zu behandeln, in denen die insulinsezernierenden Zellen durch Autoimmunität zerstört werden.

<p class = "jove_content"> Ob Tri-potente Vorläuferzellen existieren noch in erwachsenen Pankreasgänge nach Abschluss der Embryonalentwicklung eine Frage ist, die stark in der wissenschaftlichen Gemeinschaft diskutiert wird. In dieser Debatte und unter Verwendung von in – vivo – cre-lox abstammungsVerfolgungsTechniken, Inada und Mitarbeiter zeigten , dass erwachsene Maus mit einem Marker markiert duktalen Zellen, Carboanhydrase II, was zu allen ⁴ drei pankreatischen Linien geben könnte. Jedoch unter Verwendung anderer duktalen Marker, wie HNF1B ⁵ und Sox9 ^2, wurde geschlossen , dass duktalen Zellen nicht die Hauptquelle von Beta – Zellen in erwachsenen Mäusen sind.

Vor einigen Jahren vorgeschlagen, wir , dass die Ursache der oben erwähnten Diskussion des Fehlens liegen kann im Bereich ^6,7, geeigneter Analysewerkzeuge, die verwendet werden können Selbsterneuerung und multi-lineage differenzierungs zwei Kriterien notwendig zu messen , eine Stammzelle definieren. Die in – vivo – cre-lox lineage-Tracing – Technik erwähntoben kann Hinweise auf die Beziehungsebene an einer Population Vorläufer-Nachkommen zur Verfügung stellen. Allerdings ist diese Linie Tracing-Technik in ihrer Macht beschränkt auf, ob Zellen können einzelne Vorläufer erkennen Selbsterneuerung und Differenzierung in mehrere Linien. Einzelzellanalyse ist wichtig, weil, wenn mehrere Mono potent Vorläufern, die jeweils mit einem unterschiedlichen Potential lineage zusammen analysiert wurden, sie gemeinsam mit mehreren lineage Differenzierung Fähigkeiten haben können auftreten. Außerdem sind Stammzellen der Regel eine kleinere Population von einem Erwachsenen organ. Die Aktivitäten eines kleinen Zellpopulation könnte von der großen Bevölkerung maskiert werden. Daher wird ein negatives Ergebnis aus einer Population Studie nicht notwendigerweise das Fehlen von Stammzellen an. Schließlich hat cre-lox-Linie Tracing ist nicht die Messung der Selbsterneuerung ermöglichen.

Zu Beginn der Bewältigung der technischen Lücke im Bereich der Pankreas – Vorläufer Zellbiologie, Kolonie ^7-11 oder ^12-15 organoiden </sup> Assays 3D-Kultursysteme wurden unter Verwendung entwickelt. Zwei Kolonie – Assays für Pankreas – Vorläufern wurden in unserem Labor entwickelt: einer enthält eine kommerzielle Herstellung von murine extrazelluläre Matrixproteine ​​(ECM) (siehe Methods and Equipment Table) und die andere enthält Laminin – Hydrogel, ein definiertes künstliches ECM – Protein ^7-11. Progenitorzellen sind in halbfesten Medium, das Methylcellulose gemischt. Methylcellulose ist ein biologisch inert und viskoses Material aus Holzfasern hergestellt, und ¹⁶ in hämatopoetische Kolonie – Assays routinemäßig verwendet worden ist. Die Methylcellulose-enthaltende halbfeste Medium beschränkt die Bewegung der einzelnen Vorläuferzellen, so dass sie nicht wieder aggregieren. Noch ist das Medium weich genug, um eine Vorläuferzelle zu erlauben, in einer Kolonie von Zellen in dem 3D-Raum zu wachsen und differenzieren. Im Anschluss an die Tradition der Hämatologen, eine Zelle, die Pankreas-Vorläufer von was zu einer Kolonie von Zellen in der Lage war, named eine Pankreas-Kolonie bildende Einheit (PCFU). PCFUs, wenn sie in der Maus – ECM-enthaltenden Kolonie – Assay, geben Anlass zu zystischer Kolonien gewachsen , die "Ring" Kolonien ⁷ genannt werden. Nach Zugabe eines Wnt – Agonist R-spondin1, in die murine ECM-enthaltenden Kultur, schalten einige Ring Kolonien in "Dense" Kolonien ^7. In diesem Artikel werden diese beiden Arten von Kolonien in murine ECM Kultur gezüchtet zusammenfassend als "Ring / Dense" Kolonien. Wenn Ring / Dense Kolonien in einzelne Zellsuspension dissoziiert sind und neu plattiert in Kulturen , die Laminin Hydrogel enthalten, "Endokrine / acinar" Kolonien werden ⁷ gebildet.

Mit einzelnen Kolonie – Analysen wurde festgestellt , dass die Mehrheit der Ring / Dense und Endokrine / acinar Kolonien, entweder von Erwachsenen (2-4 Monate alt) ^7,11 oder junge (1 Woche alt) ⁹ Maus – Pankreas exprimieren alle drei Lineage Marker. Dies legt nahe, dass die meisten der Ursprung PCFUs sind Tri-potent. Im Maus – ECM-enthaltenden Kolonie – Assay, erwachsenen Maus PCFUs robust selbst zu erneuern und zu erweitern etwa 500.000 Mal über 11 Wochen in Kultur ^7. Murine ECM unterstützt vorzugsweise die Differenzierung von duktalen Zellen über endokrine und acinar Linien, wohingegen in Gegenwart von Laminin – Hydrogels sind murine PCFUs gefördert bevorzugt in endokrinen und Azinuszellen zu differenzieren und weniger auf die duktale lineage ^7,9,11. Wichtig ist , dass Insulin Glucagon ^{+ –} mono-hormonellen Zellen werden in der Laminin Hydrogel Kultur erzeugt und Insulin in Reaktion sekretieren Stimulation in vitro zu Glucose ^7,9, was darauf hindeutet funktionelle Reife. Die Tri-Linie Differenzierungspotential ^7,9 und Selbsterneuerung ¹¹ einzelner PCFUs werden durch einzellige Mikromanipulations bestätigt, dh die Kultivierung einer Zelle pro Vertiefung für die Koloniebildung. Zusammen bieten diese Ergebnisse Hinweise darauf, dass es sich selbst erneuernden, Tri-potent, Progenitor-ähnlichen Zellen in der postnatalen Maus Bauchspeicheldrüse, die Aktivitäten in 3D-Kultur zeigen.

Die murine PCFU Assays in diesem Artikel beschrieben werden , aus einer früheren Kolonie – Assay für abgeleitete Vorläuferzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus (mESCs) ¹⁷ differenziert gestaltet. Das Protokoll ¹⁸ im Detail in einem anderen JoVE Publikation dokumentiert. Die Kultur Komponenten und Techniken erforderlich ^17,18 die murine ECM-enthaltenden Kolonie – Assay für erwachsene PCFUs sind die gleichen wie für MESC abgeleiteten Vorläufern durchzuführen. Daher werden diese Aspekte des Assays hier nicht wiederholt werden; statt dessen werden die folgenden Verfahren werden behandelt: 1) Dissoziation des adulten Pankreas und Sortieren CD133 ⁺ Sox9 / EGFP ⁺ duktalen Zellen, die PCFUs von erwachsenen Mäusen ^7, 2) Einzelzellmanipulation der sortierten Zellen, 3) Einzelkolonie bereichern Analysen mikrofluidischen qRT-PCR und ganze-mount Immunfärbung verwendet und 4) Dissoziation von colonies in Einzelzellsuspension und Wiederbeschichtung in murine ECM oder Laminin-Hydrogel-Kolonie-Assays.