Zebra balığı bir Etanol kaynaklı Fibrotik Karaciğer Modelinin Geliştirilmesi progenitör hücre-aracılı Hepatosit Rejenerasyon Eğitim
Summary
Sustained fibrosis with deposition of excessive extracellular matrix proteins leads to cirrhosis. Alcohol abuse is one of the main causes of severe liver disease. We established an ethanol-induced zebrafish fibrotic liver model to study the mechanisms and strategies of promoting hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury.
Abstract
Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading to cirrhosis with hepatocellular dysfunction. Among multiple hepatic insults, alcohol abuse can lead to significant health problems including liver failure and hepatocellular carcinoma. Nonetheless, the identity of endogenous cellular sources that regenerate hepatocytes in response to alcohol has not been properly investigated. Moreover, few studies have effectively modeled hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury. We recently reported on establishing an ethanol (EtOH)-induced fibrotic liver model in zebrafish in which hepatic progenitor cells (HPCs) gave rise to hepatocytes upon near-complete hepatocyte loss in the presence of fibrogenic stimulus. Furthermore, through chemical screens using this model, we identified multiple small molecules that enhance hepatocyte regeneration. Here we describe in detail the procedures to develop an EtOH-induced fibrotic liver model and to perform chemical screens using this model in zebrafish. This protocol will be a critical tool to delineate the molecular and cellular mechanisms of how hepatocyte regenerates in the fibrotic liver. Furthermore, these methods will facilitate potential discovery of novel therapeutic strategies for chronic liver disease in vivo.
Introduction
Karaciğer ana parankimal hücre tipi olan hepatosit 1, dikkate değer yenilenmesi kapasitesine rağmen, kronik karaciğer yetmezliği, hepatik progenitör hücre (HPC) bağlı yenilenme 2 giden, bu yeteneği bozar.
Kronik karaciğer hasarı özellikle alkol bağımlılığı, kronik hepatit C virüsü (HCV) enfeksiyonu 3 ve non-alkolik yağlı karaciğer hastalığı (NAYKH) 4 türetilmiştir. Bu hücre-dışı matrisi (ECM) proteinlerin birikmesiyle ilişkilidir sürekli karaciğer fibrozu, yol açar. Kalıcı ECM birikimi sonradan yüksek morbidite ve mortalite ile siroz sonuçlanan bir fibröz skar dokusu 5 oluşturarak sağlam karaciğer mimarisi bozan. Birçok girişim profibrojenik sitokinler ve aktif miyofibroblastlar 6 inhibe odaklanarak esas fibrotik tepkisini azaltmak için yapılmıştır. İkinci temel olarak H (gelmiş hepatik yıldız şeklinde hücreler elde edilirSC'ler), karaciğer skar oluşumu 4 sorumlu prensip karaciğer olmayan parankimal hücreler. Bununla birlikte, sürekli fibrojenik hakaret varlığında hepatosit yeniden oluşturmak için HPC dahil endojen hücre kaynakları teşvik rejeneratif tedaviler daha ileri araştırmayı bekliyor.
karaciğer fibrozu birçok deneysel modeller, memelilerde tarif edilmiştir. Karbon tetraklorür (CCI4) tekrarlanan enjeksiyonu yaygın kemirgen ve sıçan modellerinde 7 karaciğer fibrozu uyarılması için kullanılmıştır. Yüksek yağ (HF) diyet ile birlikte alkol profibrojenik gen ekspresyonu ve karaciğer fibrozu 8 önemli bir artışıyla yol açmıştır. Steatoz (lipid birikimi), akut alkol maruz kalma sonuçları olsa da, daha ciddi karaciğer hasarı 9 duyarlı karaciğer yapar.
Zebra balığı, Danio rerio, yenilenmeyi incelerken için paha biçilmez bir omurgalı model sistem olarak ortaya çıkmıştır. gerçiBu tür semenderler ve axolotls gibi diğer alt omurgalıların Zebra balığı potansiyel rejeneratif işlemek için gerekli olan gen manipülasyonu ve görselleştirme stratejileri açısından diğer model sistemleri üzerinde avantajlara sahiptir 10 faktörleri, rejenerasyon için olağanüstü bir kapasiteye sahip. Zebra balığı da sadece kendi su etanol (EtOH) ekleyerek alkolik karaciğer hastalığı (ALD) eğitimi için cazip bir omurgalı modeli temsil etmektedir. Larva ve yetişkin zebrabalıkları Akut EtOH maruz hepatik steatoz 11-13 neden oldu. Yetişkin zebrabalıkları genişletilmiş EtOH maruz aldığında, kollajen depozisyon fibroz ile ilişkili genlerin 14 yukarı doğru düzenleme gözlenmiştir. Bununla birlikte, bir ihtiyaç fibrojenik uyarıcı olarak EtOH yanıt olarak karaciğer rejenerasyonu çalışma modellerin geliştirilmesi için bulunmaktadır.
Son zamanlarda, Zebra balığı 15 bir EtOH kaynaklı fibrotik karaciğer modeli geliştirmiştir. Biz larva ve Adul EtOH tedavi ile hepatosit özgü genetik ablasyon sistemi kombinet zebra balığı. İki transjenik satır oluşturulur, Tg (fabp10a: CFP-NTR) gt1 ve TG (fabp10a: mCherry NTR) GT2 E.coli nitroredüktaz (NTR) kontrolü altında, sırasıyla, mavi ve MCherry floresan protein, kaynaşık olduğu protein 10a, karaciğer bazik (fabp10a) promotör bağlanma hepatosit özel yağlı asit. Bu sistemde, NTR hepatositlerin açık ölümünü teşvik bir DNA arası şerit çapraz bağlama maddesi 16 bir toksik olmayan bir ön ilacı metronidazol (MTZ) dönüştürür. Bu modeli kullanarak, Çentik sinyallemesinin cevap veren karaciğer hücrelerinin bir popülasyonu, hepatositlerin civarındaki yokluğunda ECM fazla hepatositlere dönüştürülmüş olduğunu göstermiştir. Bu HPC olarak bu hücreleri belirlenmiş. Ayrıca, kimyasal ekranlar aracılığıyla, biz fibrotik karaciğerde hepatosit rejenerasyonu artırmak küçük moleküllü Wnt sinyal aktivatörleri ve Notch sinyalizasyon inhibitörleri belirledi. therefoyeniden, Zebra balığı bizim fibrotik karaciğer modeli hücre Kültürü- ya da memeli tabanlı tarama sistemi ile karşılaştırıldığında mükemmel bir kimyasal tarama sistemini temsil etmektedir. Bu önemli maliyet ve zaman tasarrufu yararları ile in vivo sistemdir. Burada bir EtOH kaynaklı fibrotik karaciğer modeli oluşturmak için ve zebrafish bu model kullanılarak kimyasal ekranları gerçekleştirmek için ayrıntılı prosedürler açıklanmaktadır. Ayrıca, zaman ders analizleri fibrotik karaciğerde gerçekleşir nasıl hepatosit rejenerasyon araştırmak için yapılmıştır. Bu protokol mekanizmaları ve fibrotik karaciğerde hepatosit rejenerasyonu sağlamak stratejilerini incelemek için paha biçilmez bir araç sağlayacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hatta I kolajen fibril tipi de dahil olmak üzere ECM proteinlerinin önemli bir miktarı mevcudiyetinde olması, HPC hepatositler olarak yeniden oluşturmak için yetkinlik korumak düşündüren, EtOH / MTZ tedavi edilen geri kazanılması karaciğerlerinde HPC aracılı hepatosit rejenerasyonu görülmektedir. EtOH, sadece tedavi HPC aktivasyonunu 15 uyarmadı ise MTZ sadece tedavi anlamlı ECM proteinlerinin birikmesini artmamıştır. Kombine EtOH / MTZ tedavisi kullanarak, biz fibrotik karaciğerd…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Biz yazının eleştirel okuma Alem Giorgis teşekkür CHS için GTEC (2731336 ve 1411318), NIH (K01DK081351) ve NSF (1354837) hibe tarafından kısmen desteklenmiştir.
Materials
| Calcium sulfate hemihydrate (CaSO4) | Acros | AC385355000 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | EMD | MX0075 | |
| 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid (PIPES) | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | F79-500 | |
| Metronidazole (MTZ) | Sigma-Aldrich | M3761 | |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| 3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) tablet | Amresco | E404 | Dissolve one tablet with 100 ml distilled water |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | BP1600 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Low-melting agarose | Amresco | BP165 | |
| Stem Cell Signaling Compound Library | Selleck Chemicals | L2100 | 10mM stock in DMSO |
| ActiProbe-1K Library | Timtec | ActiProbe-1K | 10mM stock in DMSO |
| SB 415286 | Selleck Chemicals | S2729 | Dissolve with DMSO to 10mM |
| CHIR-99021 | Selleck Chemicals | S2924 | Dissolve with DMSO to 10mM |
| Anti-Collagen I antibody | Abcam | ab23730 | Use at 1:100 for immunostaining, reacts with fish |
| AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Molecular Probes | A31573 | Use at 1:200 for immunostaining |
| Mounting media (Vectorshield) | Vector Laboratories | H-1400 | |
| 100 mm petri dish | VWR | 25384-088 | |
| 24-well plate | VWR | 10062-896 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | Dumont #55 |
| Glass slide | VWR | 48312-003 | 75×25 mm |
| Cover glass | VWR | 48366-045 | 18 mm |
| Plastic wrap | Fisher Scientific | 22305654 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 1213100 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Vibrotome | Leica | VT1000 S | |
| Stereo microscope | Leica | M80 | |
| Epifluoresent microscope | Leica | M205 FA | |
| Confocol microscope | Zeiss | LSM700 |
References
- Michalopoulos, G. K. Liver regeneration. J Cell Physiol. 213 (2), 286-300 (2007).
- Duncan, A. W., Dorrell, C., Grompe, M. Stem cells and liver regeneration. Gastroenterology. 137 (2), 466-481 (2009).
- Shepard, C. W., Finelli, L., Alter, M. J. Global epidemiology of hepatitis C virus infection. Lancet Infect Dis. 5 (9), 558-567 (2005).
- Hernandez-Gea, V., Friedman, S. L. Pathogenesis of liver fibrosis. Annu Rev Pathol. 6, 425-456 (2011).
- Bataller, R., Brenner, D. A. Liver fibrosis. J Clin Invest. 115 (2), 209-218 (2005).
- Kisseleva, T., Brenner, D. A. Anti-fibrogenic strategies and the regression of fibrosis. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 25 (2), 305-317 (2011).
- Constandinou, C., Henderson, N., Iredale, J. P. Modeling liver fibrosis in rodents. Methods Mol Med. 117, 237-250 (2005).
- Gabele, E., et al. A new model of interactive effects of alcohol and high-fat diet on hepatic fibrosis. Alcohol Clin Exp Res. 35 (7), 1361-1367 (2011).
- Lieber, C. S. Alcoholic fatty liver: its pathogenesis and mechanism of progression to inflammation and fibrosis. Alcohol. 34 (1), 9-19 (2004).
- Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nat Rev Genet. 11 (10), 710-722 (2010).
- Jang, Z. H., et al. Metabolic profiling of an alcoholic fatty liver in zebrafish (Danio rerio). Mol Biosyst. 8 (7), 2001-2009 (2012).
- Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation. Hepatology. 49 (2), 443-452 (2009).
- Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver. Hepatology. 56 (5), 1958-1970 (2012).
- Lin, J. N., et al. Development of an animal model for alcoholic liver disease in zebrafish. Zebrafish. 12 (4), 271-280 (2015).
- Huang, M., et al. Antagonistic interaction between Wnt and Notch activity modulates the regenerative capacity of a zebrafish fibrotic liver model. Hepatology. 60 (5), 1753-1766 (2014).
- Curado, S., Stainier, D. Y., Anderson, R. M. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies. Nat Protoc. 3 (6), 948-954 (2008).
- Parsons, M. J., et al. Notch-responsive cells initiate the secondary transition in larval zebrafish pancreas. Mech Dev. 126 (10), 898-912 (2009).
- Baker, K., Warren, K. S., Yellen, G., Fishman, M. C. Defective ‘pacemaker’ current (Ih) in a zebrafish mutant with a slow heart rate. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (9), 4554-4559 (1997).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J Vis Exp. (69), e4196 (2012).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. J Vis Exp. (37), (2010).
- Paku, S., Schnur, J., Nagy, P., Thorgeirsson, S. S. Origin and structural evolution of the early proliferating oval cells in rat liver. Am J Pathol. 158 (4), 1313-1323 (2001).
- Turner, R., et al. Human hepatic stem cell and maturational liver lineage biology. Hepatology. 53 (3), 1035-1045 (2011).
- Kodama, Y., Hijikata, M., Kageyama, R., Shimotohno, K., Chiba, T. The role of notch signaling in the development of intrahepatic bile ducts. Gastroenterology. 127 (6), 1775-1786 (2004).
- Ryback, R., Percarpio, B., Vitale, J. Equilibration and metabolism of ethanol in the goldfish. Nature. 222 (5198), 1068-1070 (1969).
- Mathias, J. R., Saxena, M. T., Mumm, J. S. Advances in zebrafish chemical screening technologies. Future Med Chem. 4 (14), 1811-1822 (2012).
- Chen, C. H., Durand, E., Wang, J., Zon, L. I., Poss, K. D. zebraflash transgenic lines for in vivo bioluminescence imaging of stem cells and regeneration in adult zebrafish. Development. 140 (24), 4988-4997 (2013).
- Westhoff, J. H., et al. Development of an automated imaging pipeline for the analysis of the zebrafish larval kidney. PLoS One. 8 (12), e82137 (2013).
- Perlman, Z. E., et al. Multidimensional drug profiling by automated microscopy. Science. 306 (5699), 1194-1198 (2004).
- Chu, J., Sadler, K. C. New school in liver development: lessons from zebrafish. Hepatology. 50 (5), 1656-1663 (2009).
- Choi, T. Y., Ninov, N., Stainier, D. Y., Shin, D. Extensive conversion of hepatic biliary epithelial cells to hepatocytes after near total loss of hepatocytes in zebrafish. Gastroenterology. 146 (3), 776-788 (2014).
- He, J., Lu, H., Zou, Q., Luo, L. Regeneration of liver after extreme hepatocyte loss occurs mainly via biliary transdifferentiation in zebrafish. Gastroenterology. 146 (3), 789-800 (2014).
- Yao, Y., et al. Fine structure, enzyme histochemistry, and immunohistochemistry of liver in zebrafish. Anat Rec (Hoboken). 295 (4), 567-576 (2012).
- Yovchev, M. I., Xue, Y., Shafritz, D. A., Locker, J., Oertel, M. Repopulation of the fibrotic/cirrhotic rat liver by transplanted hepatic stem/progenitor cells and mature hepatocytes. Hepatology. 59 (1), 284-295 (2014).
