Fare Embriyonik From The Heart Epikardiyal Hücrelerinin Vitro Kültür
Summary
The epicardium is an essential source of multipotent cardiovascular progenitor cells and paracrine factors that are required for cardiovascular development and regeneration. We describe here a method to culture mouse embryonic epicardial cells.
Abstract
During embryogenesis, the epicardial contribution to coronary vasculature development has been very well established. Cells derived from the epicardium differentiate into smooth muscle cells, fibroblasts and endothelial cells that contribute to the formation of coronary vessels. Here we have established an in vitro culture method for embryonic epicardial cells. Using genetic labelling, we have demonstrated that the majority of the migrating cells in our explant culture are of epicardial origin. Epicardial explant cells also retain the expression of epicardial markers (Wt1 and Tbx18). Furthermore, we provide evidence that epicardial explant cells undergo epithelial to mesenchymal transition (EMT), migrate and differentiate into smooth muscle cells after Transforming growth factor beta 1 (TGF-β1) treatment in a manner indistinguishable from that of epicardial cells in vivo. In conclusion, we provide a novel method for the culture of embryonic epicardial cells, which will help to explore the role of specific genes in epicardial cell biology.
Introduction
Deneysel verilerin bir servet epicardium kalp gelişiminde kritik adımlar etkilediğini gösterdik. Gelişimi sırasında, septum transversum proepicardium 1-4 şekilde bilinmektedir mezotelyal hücrelerinin bir yığın yol açar. proepicardium gelen hücreler, göç ve endokard oluşturucu miyokard zarf. Bunu takiben, epikardiyal hücrelerinin bir alt, daha sonra miyokard işgal epikardiyum türetilmiş hücreler (EPDCs) içindeki bir göç popülasyonuna EMT veren yükselmesine uğrar. Deney izleme genetik olarak retroviral nesilli EPDCs düz kas hücreleri, fibroblastlar, endotel hücreleri ve kardiyomiyositlerde (eğer varsa) dahil olmak üzere çeşitli soy ayırt olduğunu göstermiştir. Bu nedenle EPDCs koroner damar sistemi ve miyokard mimarisinin 1,2,4-9 gelişmesine önemli katkı sağlamaktadır. Ayrıca, epikardiyum ventriküler yoğun tabakaya 10-12 gelişimi için gereklidir. example Gittenberger-de Groot ve ark., proepicardium aşırı büyümesini inhibe etmek, örneğin ince bir miyokard, kalp ve anormal septum oluşumu eksikliği döngü gibi bir sonucu olarak, embriyo ölümüne 13 gibi kusurları bir dizi yol açtığı gösterilmiştir. embriyonik epicardium salgılanan parakrin faktörler kardiyomiyosit çoğalmasını ve farklılaşmasını modüle. Buna uygun olarak, bu tür retinoik asit (RA), fibroblast büyüme faktörleri (FGFs) ve Wnt / β-katenin olarak sinyal yollarının epikardiyum özgü silinmesi bozuk miyokardiyal büyüme ve embriyonik öldürücülüğü 14-16 sonuçlandı.
Epicardium yetişkin kalpte sessiz olduğuna inanılan olmasına rağmen, son yıllarda yapılan çalışmalarda gelişimsel bir program kardiyak hasar 17,18 aşağıdaki epicardium olarak yeniden olduğunu göstermiştir. aktivasyonu üzerine, hücreler EPDC oluşumuna neden hızla çoğalması ve EMT geçer. Bu hücreler capacit sergileyenY, fibroblast ve düz kas hücrelerinin değil kardiyomiyositlerde ve endotel hücreleri 18 ayırt etmek. Buna ek olarak, EPDCs yaralı bölgenin damarlanma yardım ve böylece enfarktüs boyutunu azaltarak gelişmiş kardiyak fonksiyonu kolaylaştıran proanjiyogenik faktörler salgılar. Nedeniyle bu bulgulara, epicardium kardiyovasküler geliştirme, hastalık ve yenilenme çalışmasında ilgi kazanmıştır.
Transgenik teknoloji 21. yüzyılda tıbbi araştırma devrim yarattı. Transgenik teknolojilerin yardımıyla, metabolik ve patofizyolojik insan durumunu taklit eden hastalıklı fare modelleri başarıyla geliştirilmiştir. Ancak, bu mutantlar epikardiyal hücre davranışını okuyan erken embriyonik öldürücülüğü kaynaklanmaktadır bir meydan okuma olmuştur. Epicardium kalp gelişim ve yenilenme oynadığı önemli rol göz önüne alındığında, biz fare epicardia için bir in vitro kültür sistemi kurdukL hücreleri. Bu yöntem, epikardiyal hücrelerin uzun süreli kültür sağlar ve endokard iki önemli özelliklerinin detaylı bir çalışma kolaylaştırır: göç eder ve ayırt etme yeteneği. fare eksize ventriküller geçiş deneyleri yürütmek için kullanılabilir kollajen jel üzerinde kültürlenebilir olabilir. Daha subepikardiyal tabakanın kollajen zengin hücre dışı matrisi çoğaltır, in vivo hücre fizyolojisi tekrarlar 3B matris içinde kültüre edildikten. Alternatif olarak daha sonra aşağı doğru çeşitli uygulamalar için kullanılabilir epikardiyal tek tabaka oluşturmak amacıyla oda slaytlar üzerinde kültürlenebilir. Bu tek-katmanın taşıma için çok önemlidir EMT geçmesi epikardiyumun yeteneği hakkında bilgiler sağlayacaktır sıkı bağlantı proteinleri için leke kullanılabilir. Buna ek olarak, farklılaşma deneyler de bu hücrelerde gerçekleştirilebilir. Bundan başka, gen ekspresyon profili hücrelerinden RNA ekstrakte ile analiz edilebilir vekantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) gerçekleştirmek. Son olarak, tek tabakalar, aynı zamanda potansiyel terapötikler test etmek için bir moleküler analiz, ardından maddelerle tedavi edilebilir. Birlikte koymak, bu epikardiyal kültür sistemi görselleştirmek ve epikardiyal gelişimi hakkında anlayışımızı furthers moleküler veri toplamak için fırsat sağlıyor.
Bu yöntemin diğer bir istenen özelliği, basittir ve herhangi karmaşık ayar gerekli olmasıdır. Kısaca, embriyolar kalp eksize E11.5 veya E12.5 aşağıda hasat edilir. ventriküller sonra kollajen jel veya oda slaytlar ya üzerinde yetiştirilmiştir. Daha sonra, bu hücreler, aşağı doğru deneyler kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kalp gelişme ve rejenerasyon epikarda artan önemi hitap epikardiyumun çalışma kolaylaştıran teknikleri geliştirmek için kilit önem taşımaktadır. epikardiyal kültür sistemi epikardiyal araştırma için önemli avantajlar getirmektedir.
Epikardiyal hücreleri izole etmek için alternatif bir yol floresans ile aktive edilen hücre tasnif (FACS) kullanmaktır. Bu yöntem, diğer soylarından epikardiyal hücreleri ayırmak için epikardiyal belirteçleri (veya floresan protein ep…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma DUKE-NUS Lisans Tıp Fakültesi Singapur, Manvendra K. Singh Goh vakıf ve Singapur NRF bursu (NRF-NRFF2016-01) fon tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Life tech invitrogen | 11995065 |
| Penicillin/streptomycin solution | Life tech invitrogen | 15140122 |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life tech invitrogen | 10500064 |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148-5KG |
| Recombinant fibroblast growth factor 2 (FGF2) | PeproTech | 450-33 |
| Recombinant transforming growth factor beta 1 (TGF-β1) | PeproTech | 100-21 |
| ZO-1 antibody | Life tech invitrogen | 40-2200 |
| α-Tubulin antibody | Sigma | T 6074 |
| α-smooth muscle actin (SMA) antibody | Sigma | A 2547 |
| Phalloidin antibody | Life tech invitrogen | A12379 |
| 3D Collagen Culture kit | Millipore | ECM 675 |
| 8-well chamber slide | Fisher Scientific | NNU 154534-PK |
| Trizol reagent | Life Technologies | 15596-018 |
| ViiA 7 Real-Time PCR System | Life Technologies | 4453536 |
| Superscript First Strand Synthesis kit | Life Technologies | 11904-018 |
References
- Mikawa, T., Fischman, D. A. Retroviral analysis of cardiac morphogenesis: discontinuous formation of coronary vessels. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 9504-9508 (1992).
- Mikawa, T., Gourdie, R. G. Pericardial mesoderm generates a population of coronary smooth muscle cells migrating into the heart along with ingrowth of the epicardial organ. Dev Biol. 174, 221-232 (1996).
- Manner, J., Perez-Pomares, J. M., Macias, D., Munoz-Chapuli, R. The origin, formation and developmental significance of the epicardium: a review. Cells Tissues Organs. 169, 89-103 (2001).
- Gittenberger-de Groot, A. C., Vrancken Peeters, M. P., Mentink, M. M., Gourdie, R. G., Poelmann, R. E. Epicardium-derived cells contribute a novel population to the myocardial wall and the atrioventricular cushions. Circ Res. 82, 1043-1052 (1998).
- von Gise, A., Pu, W. T. Endocardial and epicardial epithelial to mesenchymal transitions in heart development and disease. Circ Res. 110, 1628-1645 (2012).
- Katz, T. C., et al. Distinct compartments of the proepicardial organ give rise to coronary vascular endothelial cells. Dev Cell. 22, 639-650 (2012).
- Singh, M. K., Lu, M. M., Massera, D., Epstein, J. A. MicroRNA-processing enzyme Dicer is required in epicardium for coronary vasculature development. J Biol Chem. 286, 41036-41045 (2011).
- Degenhardt, K., Singh, M. K., Epstein, J. A. New approaches under development: cardiovascular embryology applied to heart disease. J Clin Invest. 123, 71-74 (2013).
- Singh, M. K., Epstein, J. A. Epicardium-derived cardiac mesenchymal stem cells: expanding the outer limit of heart repair. Circ Res. 110, 904-906 (2012).
- Manner, J. Experimental study on the formation of the epicardium in chick embryos. Anat Embryol (Berl). 187, 281-289 (1993).
- Manner, J., Schlueter, J., Brand, T. Experimental analyses of the function of the proepicardium using a new microsurgical procedure to induce loss-of-proepicardial-function in chick embryos. Dev Dyn. 233, 1454-1463 (2005).
- Pennisi, D. J., Ballard, V. L., Mikawa, T. Epicardium is required for the full rate of myocyte proliferation and levels of expression of myocyte mitogenic factors FGF2 and its receptor, FGFR-1, but not for transmural myocardial patterning in the embryonic chick heart. Dev Dyn. 228, 161-172 (2003).
- Gittenberger-de Groot, A. C., Vrancken Peeters, M. P., Bergwerff, M., Mentink, M. M., Poelmann, R. E. Epicardial outgrowth inhibition leads to compensatory mesothelial outflow tract collar and abnormal cardiac septation and coronary formation. Circ Res. 87, 969-971 (2000).
- Lavine, K. J., et al. Endocardial and epicardial derived FGF signals regulate myocardial proliferation and differentiation in vivo. Dev Cell. 8, 85-95 (2005).
- Merki, E., et al. Epicardial retinoid X receptor alpha is required for myocardial growth and coronary artery formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 18455-18460 (2005).
- Stuckmann, I., Evans, S., Lassar, A. B. Erythropoietin and retinoic acid, secreted from the epicardium, are required for cardiac myocyte proliferation. Dev Biol. 255, 334-349 (2003).
- Huang, G. N., et al. C/EBP transcription factors mediate epicardial activation during heart development and injury. Science. 338, 1599-1603 (2012).
- Zhou, B., et al. Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors. J Clin Invest. 121, 1894-1904 (2011).
- Christoffels, V. M., et al. Tbx18 and the fate of epicardial progenitors. Nature. 458, 8-9 (2009).
- Rudat, C., Kispert, A. Wt1 and epicardial fate mapping. Circ Res. 111, 165-169 (2012).
- Duim, S. N., Kurakula, K., Goumans, M. J., Kruithof, B. P. Cardiac endothelial cells express Wilms’ tumor-1: Wt1 expression in the developing, adult and infarcted heart. J Mol Cell Cardiol. 81, 127-135 (2015).
- Iyer, D., et al. Robust derivation of epicardium and its differentiated smooth muscle cell progeny from human pluripotent stem cells. Development. 142, 1528-1541 (2015).
- Witty, A. D., et al. Generation of the epicardial lineage from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 32, 1026-1035 (2014).
