Экстракорпоральное культуры эпикардиального клеток из эмбриональных сердца

Богатство экспериментальных данных показано, что Эпикард влияет на критические шаги в развитии сердца. В процессе разработки, перегородку transversum приводит к глыбе мезотелиальной клеток , известных как proepicardium ^1-4. Клетки из proepicardium затем мигрируют и конверт миокард, образующий эпикарда. Вслед за этим подмножеством эпикарда клетки подвергаются ЕМТ порождая миграционным популяции эпикарда клеток, полученных (EPDCs), которые впоследствии проникают в миокард. Генетический а также ретровирусный родословная отслеживании эксперименты показали, что EPDCs дифференцироваться в различные клоны, включая гладкомышечные клетки, фибробласты, эндотелиальные клетки и кардиомиоциты (если таковые имеются). Поэтому EPDCs вносят значительный вклад в развитие коронарных сосудов и миокарда архитектуры ^1,2,4-9. Кроме того, эпикарда имеет важное значение для развития желудочковой компактного слоя ^10-12. При еXample Gittenberger-де Грут и др. показали , что ингибирование вырост proepicardium приводит к массиву дефектов , таких как тонкий миокарда, дефицитной зацикливание сердца и аномальному образованию межжелудочковой перегородки и в результате, к эмбриональной летальности ^13. ПАРАКРИННОЙ факторы, секретируемые из эмбрионального эпикарда модулировать пролиферацию кардиомиоцитов и дифференцировки. В соответствии с этим, эпикарда конкретных удаление сигнальных путей , таких как ретиноевая кислота (RA), факторы роста фибробластов (ФРФ) и Wnt / -катенина привело к дефектной роста миокарда и эмбриональной летальности ^14-16.

Хотя эпикарда , как полагают, в состоянии покоя у взрослых сердец, недавние исследования показали , что программа развития будет возобновлена ​​в эпикарда после остановки травмы ^17,18. После активации клетки подвергаются быстрой пролиферации и EMT, которые приводят к образованию EPDC. Эти клетки демонстрируют CapacitY дифференцироваться в фибробластах и клетках гладкой мускулатуры , но не кардиомиоцитов или эндотелиальных клеток ^18. Кроме того, EPDCs секретируют проангиогенные факторы, которые помогают в васкуляризации поврежденной области и тем самым облегчают улучшенную функцию сердца за счет уменьшения размера инфаркта. Из-за этих выводов Эпикард приобрел интерес к изучению сердечно-сосудистых заболеваний, развития и регенерации.

Трансгенные технологии произвели революцию медицинских исследований в 21-м веке. С помощью трансгенных технологий, заболевшие мышиные модели, имитирующие человеческое состояние метаболически и патофизиологически были успешно разработаны. Однако, изучая эпикарда поведение клеток в этих мутантов было проблемой, главным образом из-за ранней эмбриональной летальности. Учитывая значительную роль , которую играет в эпикарда сердца развития и регенерации, мы создали систему культивирования в пробирке для epicardia мышил клетки. Этот метод позволяет долгосрочную культуру эпикарда клеток и облегчает детальное изучение двух важных свойств эпикарда: его способность мигрировать и дифференцироваться. Исключены желудочки от мыши могли быть культивированы на коллагеновые гели, которые могут быть использованы для проведения анализов миграции. Культивируются в 3D – матрицу , которая повторяет коллаген богатых внеклеточного матрицу субэпикардиального слоя лучше повторяет в естественных условиях физиологии клетки. В качестве альтернативы они могут быть культивированы на камерные слайды в целях создания эпикарда монослой, который затем может быть использован для различных последующих применений. Этот монослой может быть использован для окрашивания для плотных соединений белков, которые будут обеспечивать представление о способности эпикарда претерпевать EMT что имеет решающее значение для миграции. Кроме того, эксперименты дифференцировки также могут быть выполнены на этих клетках. Кроме того, профиль экспрессии генов может быть проанализирован путем экстракции РНК из клеток ивыполняя количественной полимеразной цепной реакции (КПЦР). И, наконец, монослои также можно лечить с агентами, за которыми следует молекулярный анализ, чтобы проверить на потенциальных терапевтических средств. Соединенный, эта система эпикардиальная культура дает нам возможность визуализировать и собирать молекулярные данные, которые наше понимание улучшить систему о эпикардиального развития.

Другим желательным признаком этого способа заключается в том, что он прост и не требует дополнительных настроек. Вкратце, зародыши собирают на E11.5 или E12.5, после чего вырезают сердце. Желудочки затем культивировали на любом коллагеновым гелем или камерные слайды. Затем эти клетки могут быть использованы для проведения экспериментов ниже по течению.