Coltura in vitro di cellule provenienti da epicardici Cuore embrionali di topo

Un patrimonio di dati sperimentali hanno mostrato che l'epicardio influenza passaggi critici nello sviluppo cardiaco. Durante lo sviluppo, la transversum setto dà luogo ad un gruppo di cellule mesoteliali noto come proepicardium ^1-4. Le cellule del proepicardium poi migrano e la busta miocardio formare il epicardio. In seguito, un sottogruppo di cellule epicardici subiscono EMT dando luogo ad una popolazione di cellule migratoria epicardio-derivato (EPDCs) che poi invadono il miocardio. Genetica così come retrovirale lignaggio tracciando esperimenti hanno dimostrato che EPDCs differenziarsi in vari lignaggi comprese le cellule muscolari lisce, i fibroblasti, cellule endoteliali e cardiomiociti (se presenti). Pertanto EPDCs contribuiscono significativamente allo sviluppo del sistema vascolare coronarico e architettura miocardica ^1,2,4-9. Inoltre, l'epicardio è essenziale per lo sviluppo dello strato compatto ventricolare ^10-12. per postaxample Gittenberger-de Groot et al. hanno dimostrato che inibendo la conseguenza del proepicardium porta ad una serie di difetti come un miocardio sottile, loop carente del cuore e anormale formazione setto interventricolare e, di conseguenza, embrionali letalità ^13. fattori paracrini secreti dal dell'epicardio embrionale modulano la proliferazione dei cardiomiociti e differenziazione. Coerentemente con questo, specifici per epicardium cancellazione dei percorsi di segnalazione come l'acido retinoico (RA), i fattori di crescita dei fibroblasti (FGF) e Wnt / β-catenina ha provocato la crescita del miocardio difettoso e letalità embrionale ^14-16.

Anche se il epicardio è stato creduto di essere quiescente nei cuori adulti, recenti studi hanno dimostrato che il programma di sviluppo si riattiva nel epicardio seguente lesione cardiaca ^17,18. Dopo l'attivazione, le cellule subiscono una rapida proliferazione e EMT che si traducono in formazione EPDC. Queste cellule presentano la capacity di differenziarsi in fibroblasti e cellule muscolari lisce, ma non cardiomiociti e cellule endoteliali ^18. Inoltre, i EPDCs secernono fattori pro-angiogenici che gli aiuti nella vascolarizzazione della zona danneggiata e quindi facilitare il miglioramento della funzione cardiaca, riducendo la dimensione dell'infarto. A causa di questi risultati, l'epicardio ha guadagnato interesse per lo studio dello sviluppo cardiovascolari, malattie e rigenerazione.

tecnologia transgenica ha rivoluzionato la ricerca medica nel 21 ° secolo. Con l'aiuto di tecnologie transgeniche, modelli di malati di topo che mimano la condizione umana metabolicamente e fisiopatologico sono stati sviluppati con successo. Tuttavia, lo studio del comportamento delle cellule epicardico in questi mutanti è stata una sfida dovuta principalmente ai primi di letalità embrionale. Considerando il ruolo significativo che la epicardio gioca nello sviluppo cardiaco e la rigenerazione, abbiamo istituito un sistema di coltura in vitro per epicardia del mouseL cellule. Questo metodo permette la coltura a lungo termine delle cellule epicardici e facilita lo studio dettagliato delle due proprietà importanti dell'epicardio: la sua capacità di migrare e differenziarsi. I ventricoli escisse dal mouse potrebbero essere coltivati ​​in gel di collagene che possono essere utilizzati per condurre saggi di migrazione. Essendo coltivate in una matrice 3D che replica la matrice extracellulare ricca di collagene dello strato subepicardico meglio riassume il vivo fisiologia cellulare in. In alternativa possono essere coltivate su vetrini da camera per stabilire un monostrato epicardico che può quindi essere utilizzato per una varietà di applicazioni a valle. Questo monostrato può essere utilizzato per colorare per proteine ​​di giunzione stretti che forniranno approfondimenti sulla capacità del epicardio sottoporsi EMT che è cruciale per la migrazione. Inoltre, esperimenti differenziazione possono essere effettuati anche su queste cellule. Inoltre, profilo di espressione genica può essere analizzata per estrarre l'RNA dalle cellule el'esecuzione di reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR). Infine, i monostrati potrebbero anche essere trattati con agenti seguita da un'analisi molecolare per verificare le potenziali terapie. Mettere insieme, questo sistema di coltura epicardico ci offre la possibilità di visualizzare e raccogliere dati molecolare che favorisce la nostra comprensione dello sviluppo epicardico.

Un'altra caratteristica desiderabile di questo metodo è che è semplice e non richiede alcuna configurazione elaborata. In breve, gli embrioni vengono raccolte al E11.5 E12.5 o in seguito alla quale il cuore è asportato. I ventricoli sono poi coltivate su entrambi i gel di collagene o diapositive da camera. Successivamente, queste cellule possono essere usate per condurre esperimenti a valle.