In Vitro Cultuur van epicardiale cellen uit muis embryonale Heart

Een schat aan experimentele gegevens hebben aangetoond dat het epicard beïnvloedt kritische stappen in de ontwikkeling van het hart. Tijdens de ontwikkeling, het septum transversum leidt tot een klompje mesotheelcellen zogenaamde proepicardium ^1-4. Cellen uit de proepicardium dan migreren en de envelop van de hartspier die het epicard. Vervolgens een subset van epicardiale cellen ondergaan EMT waardoor een trekkende populatie van epicard afgeleide cellen (EPDCs) dat vervolgens de hartspier binnendringen. Genetische en retrovirale lineage tracing experimenten hebben aangetoond dat EPDCs differentiëren in diverse lineages, waaronder gladde spiercellen, fibroblasten, endotheelcellen en cardiomyocyten (indien aanwezig). Daarom aanzienlijk EPDCs bijdragen aan de ontwikkeling van de coronaire vaatstelsel en myocard architectuur ^1,2,4-9. Bovendien is het epicard is essentieel voor de ontwikkeling van ventriculaire compacte laag ^10-12. voor example Gittenberger-de Groot et al. aangetoond dat remming van de uitgroei van de proepicardium leidt tot een scala aan defecten zoals een dunne myocardium deficiënte lussen van het hart en abnormale vorming interventriculair septum en daardoor embryonale letaliteit ^13. Paracriene factoren uitgescheiden door de embryonale epicard moduleren cardiomyocyt proliferatie en differentiatie. Consistent hiermee epicard-specifieke deletie van signaaltransductiewegen zoals retinoïnezuur (RA), fibroblast groeifactoren (FGF's) en Wnt / β-catenine resulteerde in defecte myocardiale groei en embryonale letaliteit ^14-16.

Hoewel de epicard werd geloofd rustig bij volwassen harten te zijn, hebben recente studies aangetoond dat de ontwikkelings-programma wordt geactiveerd in de epicard volgende cardiale letsel ^17,18. Na activering van de cellen ondergaan snelle proliferatie en EMT die resulteren in EPDC formatie. Deze cellen vertonen de capacity te differentiëren in fibroblasten en gladde spiercellen, maar niet cardiomyocyten of endotheelcellen ^18. Bovendien, de EPDCs scheiden pro-angiogene factoren die helpen bij de vascularisatie van de gewonde gebied en dus naar een verbeterde hartfunctie door vermindering van de infarctgrootte. Vanwege deze bevindingen, is het epicard belangstelling voor het onderzoek van hart- en ontwikkeling, ziekte en regeneratie gewonnen.

Transgene technologie heeft een revolutie teweeggebracht in het medisch onderzoek in de 21e eeuw. Met behulp van transgene technologie, zieke muismodellen nabootsen van de menselijke conditie metabolisch en pathofysiologisch zijn met succes ontwikkeld. Echter, het bestuderen van de epicardiale cel gedrag in deze mutanten is een uitdaging vooral te wijten aan de vroege embryonale dodelijkheid geweest. Gezien de belangrijke rol die het speelt in het epicard cardiale ontwikkeling en regeneratie, hebben wij een in vitro kweeksysteem voor muizen epicardia vastgesteldl cellen. Deze methode kan de lange termijn kweek van epicardiale cellen en vergemakkelijkt de gedetailleerde studie van de twee belangrijke eigenschappen van het epicard: het vermogen om te migreren en te differentiëren. De uitgesneden ventrikels van de muis kan worden gekweekt op collageen gels die kunnen worden gebruikt om migratie assays voeren. Wordt gekweekt in een 3D matrix die de collageen-rijke extracellulaire matrix van de subepicardiale laag repliceert beter de in vivo recapituleert celfysiologie. Als alternatief kunnen ze worden gekweekt op objectglaasjes kamer om een ​​epicardiale monolaag die vervolgens kan worden gebruikt voor verschillende stroomafwaartse toepassingen stellen. Deze monolaag kan worden gebruikt om kleur wordt tight junction eiwitten die inzichten op het vermogen van het epicard met EMT ondergaan die cruciaal is voor migratie bieden. Bovendien differentiatie experimenten kunnen worden uitgevoerd door deze cellen uitgevoerd. Verder kan genexpressieprofiel worden geanalyseerd door het extraheren van RNA uit de cellen enhet uitvoeren van kwantitatieve polymerase chain reaction (qPCR). Tenslotte kunnen de monolagen worden behandeld met middelen, gevolgd door moleculaire analyse voor het testen van potentiële therapeutische middelen. In elkaar gezet, dit epicardiale cultuur systeem biedt ons de mogelijkheid om te visualiseren en moleculaire gegevens die ons begrip over epicardiale ontwikkeling bevordert te verzamelen.

Een andere gewenste eigenschap van deze werkwijze is dat het eenvoudig en zonder ingewikkelde installatie vereist. In het kort, worden de embryo's geoogst op E11.5 en E12.5 waarna het hart wordt weggesneden. De ventrikels worden vervolgens gekweekt op hetzij collageengel of kamer dia. Vervolgens kunnen deze cellen worden gebruikt voor stroomafwaartse experimenten.