Zararlı ve Potansiyel Zararlı Bileşenlerinin Toksikolojik etkilerinin değerlendirilmesi için yüksek İçerik Tarama Analizi (HPHC)

1. Hasat Normal İnsan Bronş Epitel Hücreleri (NHBEs) Ön sıcak hücre kültür ortamı (bronşiyal epitel hücre büyüme ortamı ile desteklenmiş aracı madde), 37 ° C'de su banyosu içinde HEPES, tripsin ve tripsin nötrleştirme çözeltisi (TNS). izdiham% 80'i ulaşıldığında hücreler hasat. Not: koşulları Tohumlanmayı takiben NHBE hücre kültürü, 20 ml ortam ile kaplanmamış T75 şişelerinde uygun izdiham elde etmek için kullanılabilir: 3 günlük kültürü için 1 x 10 6 hücre, 4 günlük kültürü için 0,5 x 10 6 hücre ve 5 günlük kültür için 0.25 x 10 6 hücre Tohum. Hücreler besin yenilemek için kültüründe zaman 2 günde orta değiştirin. Kültür, 37 ° C'de hücre ve% 5 CO2. Şişeye (ler) süpernatantı ve hücreleri yıkamak için HEPES ilave (örneğin., 75 cm 2 şişeye 3 ml) eklenmiştir. HEPES sol ile hücre mono tabakasının örtecek şekilde her şişeye döndürerekKatkı. HEPES çözeltisini çıkarın ve tripsin solüsyonu (örn., 75 cm 2 şişeye 3 ml) eklenmiştir. Tripsin çözeltisi hücre tek tabaka kapak şişeye döndürün. 37 ± 2 ° C 'de 5 dakika süre ile bir balon inkübe edin. mikroskop altında hücre ayrışması izlenmesi ve gerekirse, daha inkübe ve yavaşça geri kalan bağlı hücreler serbest bırakmak için şişeyi dokunun. Reaksiyonu durdurmak için TNS ekleyin (örn., 75 cm 2 şişeye 3 mi) ve 15 ml'lik bir tüp hücre süspansiyonu aktarın. 5 dakika boyunca 300 x g'de hücre süspansiyonu santrifüj. Süpernatant atılır ve homojen bir hücre süspansiyonu elde etmek için hafifçe karıştırılarak, taze ortam 10 ml hücre pelletini yeniden askıya. hücreler agrega kaldırmak ve saymak için 100 mcM hücre süzgecinden hücre süspansiyonu Filtre. Not: laboratuvarımızda bir elektrik alanı çok kanallı hücresi sayma sistemi hassas ve tutarlı bir viabl değerlendirmek için kullanıldıe hücre sayısı. 2. Gerçek Zamanlı Hücre Analiz (RTCA) Doz Aralığı Bulma (DRF) tabanlı NOT: 1) 2) seçin bileşikler ayrıca HCS tarafından araştırılması gereken, bileşik toksisitesini değerlendirmek ve 3) HCS için uygun dozlar seçin: Bir empedans tabanlı ölçüm sistemi kullanıldı. RCTA plakalarda NHBE hücreleri her bir 100 ul ortam mevcut test bileşiği dilüsyonları 25 ul eklenmesi ile dozlanmıştır. Bu nedenle, tüm test solüsyonları 5 kez (5x), istenen nihai konsantrasyonda hazırlanır. Yayımlama NHBE Hücreler empedans ölçüm sayısını ve süresini tanımlamak için enstrüman Program. Bu çalışmada, veriler 48 saat boyunca her 15 dakikada bir kaydedilmiştir (24 saat ila ± 2 saat önce ve test maddeleri ile hücrelerin dozlamadan sonra 24 saat). 96 oyuklu bir RTCA plakanın her oyuğuna önceden ısıtılmış sıvının 50 ul pipetleme plaka arka ölçün. Not: Bu adım, bir teknik gereklilik temsilalet daha sonra hücre bazlı hesaplama için bir temel referans olarak kullanılan, orta elektrik direncini hesaplamak için kullanılır. 50 ul / oyuk ortamın zaten aracı arka planı için ilave edildiği RTCA plakanın her oyuğuna (7200 hücre / oyuk) 144,000 hücre / ml (±% 5) bir konsantrasyonda bir hücre süspansiyonu ve 50 ul hücre süspansiyonu ekleyin ölçüm. Hücreler (hücrelerin homojen dağılımını iyileştirmek için) RTCA yuvasının içine yerleştirmeden önce, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca uygun olsun. Inkübatör (37 ° C ve% 5 CO2) 'de RTCA beşiği RTCA inkübe edin ve dozlamadan önce önümüzdeki 24 ± 2 saat süre ile veri kayıt başlar. HPHCs ve Pozitif Kontroller çözeltiler Pozitif Kontrol Sulandırma Staurosporin stok solüsyonu, DMSO içinde (10 mM) 1:10 d 5 ul (bakınız Tablo 3) ile seyreltilirortamın 195 ul ilution 5x çalışma çözeltisi elde edildi. HPHC Sulandırma / Çözülür 1 M stok çözelti oluşturmak için araç (Tablo 2), her HPHC seyreltin. 100 mM'lik çözelti oluşturmak için bir ortam içinde, her HPHC stok solüsyonu 1:10 seyreltilir. 5x çalışma çözümleri (Şekil 2) elde etmek için orta +% 10 araç kullanırken bir beş adım 1:10 seri seyreltme yapılarak "bileşik ana plaka" oluşturun. Not: Son olarak, son dozlar: 0.2 uM, 2 uM, 20 uM, 0.2 mM, 2 mM, 20 mM. Ayrıca, bu aşamada, sadece aracın karşılık gelen dozu 0 hazırlanması. Doz RTCA enstrüman Pause ve plakayı çıkarmak için beşik açın. plaka çıkarın ve RTCA dışında deneysel işlemler sırasında RTCA plakanın ısısını dengelemek için tasarlanmış RTCA plaka sıcaklığı aracı (koyunistasyonu) empedans ölçümü etkileyebilecek hücreleri, soğutma önlemek için. (Şekil 2) (satır sayısı 7 üst satır ve araç kontrolü en yüksek doz) Bileşik ana plakası aynı doz düzeni sağlamak üç kopya halinde hücrelere "bileşik ana plaka" 25 ul 5x çözüm ekleyin. Mevcut (100 ul) hücre kültür ortamı çıkarmayın. Mevcut kültür ortamı çıkarmadan alt satırda (yarım-sağ) hücrelere 25 ul 5x pozitif kontrol çözüm ekleyin. Mevcut hücre kültür ortamı çıkarmadan alt satır (yarı sol) hücrelere 25 ul ortam ekleyin. Plaka patı ile plaka mühür. geri RTCA beşiğinde plaka koyun ve kilitleyin. İstenen maruz kalma süresi için kayıt Yeniden veriler (örneğin., 24 saat). Not: Bu sızdırmazlık filmin kullanılması iyi-iyi çapraz kontaminasyon dahil olmak üzere potansiyel kontaminasyonu önlemek için tavsiye edilir. <strong> Veri Analizi RTCA ve LD 50 Hesaplama Bir metin (.txt) veya excel (.xls) dosyası olarak ihracat ham veriler. Not: Dosya plaka düzeni (Bileşikler, dozlar ve iyi pozisyonu) ile ilgili tüm bilgileri içerir. Ham hücre endeks değerleri 96 kuyu biçimi (yansıtma plaka kuyu dağılımı) düzenlenmiştir ve kayıt meydana geldiği her zaman noktalarında verilmektedir. T zamanında 96 oyuklu bir plaka içerisinde pozisyonda I, Cl değerinin T (I) ile gösterilir. Bir normalleşme olarak tanımlamak 96 plaka her pozisyon i (doz öncesi son zaman noktası referans örneğin, Hücre Endeksi 23 saat 50 dakika pozisyon i CI t (i) = 23 ° C'de 00 sn: 50: 00 = CI Referans (I) '). Not: dozajlama gerçekleştirildiğinde Bu bilgiler açıklamalı gerekir. Bölme, iyi bazında, normalizasyon referans olarak her zaman nokta değerleri dozlama anda tüm değerlerini normalize. positio normalize değeriNi t zamanında 96 oyuklu bir plaka içerisinde, NCI t (i) ile ifade edilir ve bu nedenle tüm t NCI T (I) '= Cl T (I) / CI Referans: (i) ile tanımlanır. 24 saat sonra, eğri (AUC) altındaki alanı hesaplayın pozitif kontrol ve araç için pozisyonlar da dahil olmak üzere, (96 oyuklu bir plaka içerisinde konumu I), her bir numune bir post-dozlama. Ben her dikdörtgenin alanları toplanmasıyla elde edilir pozisyonda AUC elde, iki timepoints arasında olmak her dikdörtgen t k ve t l (t k <t l) ile gösterilir; X = T l x * y kullanılarak her bir dikdörtgen alanı hesaplamak – T K, iki zaman noktalarında ve Y, iki zaman noktalarında (y = (NCI TK, (i) + NCI TP (I) ') aktivitesi ortalama olarak arasındaki mesafe olarak / 2). Not: AUC 24 saat sonra I AUC (I) 'ile gösterilir pozisyon için kan örnekleri alındı. Tüm koşullar üçlü kuyucuklara plakalanır gibi üç değerlerinin ortalaması kullanılmaktadır. <li> Aşağıdaki denklemi kullanarak değerleri normalize: burada i AUC 24 saat sonra-dozlama hesaplandı olan 96 oyuklu bir plaka içerisinde konumu, Araç, 24 saat sonra-dozlama bir plaka aracın kuyuları için AUC değerlerinin ortalama olduğu Pozitif kontrol, 24 saat sonra-dozlama bir plaka pozitif kontrol kuyuları için AUC değerlerinin ortalama olduğu Veya aracı (% 0) için arzu edilen ortalama normalize değeri, ve SC pozitif kontroller için istenen medyan normalleştirilmiş değeri (-100%) NOT: Bu aşamanın sonunda, bir veri kümesi de I ve karşılık gelen / konumunda yer alan örnek uygulandığı (logaritmik birimi olarak) 96 oyuklu bir plaka, bir toplama CI her konum i, içeren elde edilen 24 saat AUC_normaliz sonrası dozlama normalize AUCEd (i). Arsa ve uyum (i AUC_normalized (i) c) 4-parametreleri Tepesi denklem kullanılarak -Değerler. Mümkün olduğunda, aynı zamanda LD 50 hesaplayın. burada Y = AUC_normalized, Test bileşiği sıfır konsantrasyonunda sıfır Etkinlik S 0 = Etkinlik düzeyi, Sonsuz konsantrasyonda sonsuz Etkinlik S inf = Etkinlik düzeyi, Etkinlik maksimum seviyenin% 50 ulaştığı AC50 = Konsantrasyon, Hill katsayısı n = AC50 de yamaç Tedbir ve Doz-tepki eğrisi çizilir x-ekseni üzerindeki değerler karşılık gelen logaritmik birimleri c = konsantrasyon. NOT: AC50 LD 50 (sitotoksisite deneyleri) karşılık gelir. Düşük değerler, yüksek kuvvetini gösterir tesirliliğinin bir ölçüsüdür. 3. HCS tarafından Toksikolojik Etkilerinin Ölçülmesi NOT: Altı farklı deneylerde gruplandırılmış toksisite dokuz çok parametrik belirteçlerin, toplam, HCS platformu (Tablo 1) kullanılarak ölçülür. RTCA hücre canlılığı analizine göre (Bölüm 2), her bir bileşenin doz aralığı tanımlanır ve 3R4F referans dozunun da dahildir. Referans doz referans sigara 3R4F itibaren bir sopa duman HPHC miktarına eşdeğerdir. Yayımlama NHBE Hücreler (12,000 hücre / oyuk) 120,000 hücre / ml (±% 5) bir hücre süspansiyonu hazırlamak ve 96 oyuklu HCS plakanın her oyuğuna 100 ul hücre süspansiyonu ekleyin. Tüm tahliller (Sitotoksisite, DNA hasarı, Stres kinaz, ROS, GSH içeriği ve Apoptozis) ve zaman noktalarında (4 ve 24 saat) değerlendirilmesi için yeterli tabak hazırlayın. Hücreler oyuklara ekleyin ve daha sonra 3 inkübe izin 30 dakika boyunca oda sıcaklığında HCS plakaları boş7 ° C ve dozlamadan önce 24 ± 2 saat süre ile% 5 CO2. HCHPs ve Pozitif Kontroller seyreltilmesi Not: HCS plakalarda NHBE hücreleri her bir zaten mevcut ortamın 100 ul test numunesi çözeltilerin 25 ul ekleyerek dozlanacaktır. Bu nedenle, tüm dozlar 5x arzu edilen nihai konsantrasyonu hazırlanır. Pozitif Kontroller Sulandırma (Pozitif Kontrol Plaka) Her bir pozitif kontrol stok çözeltisi 40 ul koyun Sütun # 2 (Şekil 4a, kırmızı gölgeli Wells) (Tablo 3). Sütun 3. ve 5. (Şekil 4a, açık mavi gölgeli kuyu) ve sütun # 4 aracın 40 ul (Şekil 4a, açık mavi gölgeli kuyu) aracın 20 ul koyun. Sütun # 2 kuyulardan 12 ul çekilme sütun # 3 kuyulara onu dağıtmak ve karıştırın (Şekil 4b)Elde edilir ve her pozitif kontrol bileşiği (Şekil 4c) 3 doz (D1, D2 ve D3) ve araç (V) ile son bir seri seyreltme kadar devam eder. Pozitif kontrol plakası üretmek için, ortam (Şekil 4d) bileşiklerin bir 1:40 seyreltme hazırlar. HPHC Sulandırma (Bileşik Master Plaka) Not: HCS HPHCs seçilen doz aralıkları Tablo 2'de listelenmiştir. 100 mM'lik bir konsantrasyon için bir ortam içinde, her HPHC stok solüsyonu (1 M) 1:10 seyreltilir. Her HPHC için seçilen 5x dozları elde etmek için% 10 araç ile orta kullanarak dilüsyonları gerçekleştirin. Doz (Şekil 5) (satır sayısı 7 üst satır ve taşıyıcı kontrol içinde yüksek doz) Bileşik ana plaka ile aynı dozaj düzeni sağlamak üç kopya halinde hücrelere bileşiği, ana plakadan 5x çözeltiler 25 ul ekle. e çıkarmayınxisting (100 ul), hücre kültürü ortamı. Pozitif kontrol plakası (Şekil 5) ile aynı dozaj düzeni sağlamak alt satırında hücrelere pozitif kontrol plakasından 5x çözeltisi 25 ul ekle. Mevcut (100 ul) hücre kültür ortamı çıkarmayın. Not: Her deney belirli pozitif kontrole sahip olması; Tablo 3. İstenilen pozlama süresi (4 veya 24 saat) 37 ° C ve% 5 CO 2 inkübe plakası bakın. boyanma Tüm deneyler için hazırlık Yıkama tamponu (PBS) ile 37 ° C'de çözeltiler önceden ısıtın. 37 ° C'de yıkama tamponu ve önceden sıcak bunun 89,19 ml 10.81 mi formaldehid% 37 eklenmesi sabitleme çözeltisi (% 4 formaldehid çözeltisi) hazırlayın. 37 ° C'de yıkama tamponu ve önceden sıcak bunu 90 ml 10x permeabilizasyon tampon maddesi 10 ml ekleyerek permeabilizasyon tamponu hazırlayın. Blo hazırlayın37 ° C'de yıkama tamponu ve önceden sıcak bunun 90 ml bloklama tamponu 10x, 10 ml ekleyerek cking tamponu. 37 ° C'de hücre kültürü ortamı önceden ısıtın. 4 ve 24 saat pozlama süreleri ulaşıldığında kez inkübatör HCS plakaları çıkarın ve her bir deney için aşağıdaki özel protokoller gerçekleştirin. Sitotoksisite Deneyi aşağıdaki formüle göre Canlı Hücre Boyama Çözüm yeterli hacmi (V) hazırlayın: Orta Hacmi (ul) V = 50 x 1.2 x (kuyuların W sayısı) W satıcının talimatlarına uygun olarak Canlı Hücre Boyama Çözüm Mitokondri boya sulandırmak. satıcının talimatlarına uygun olarak Canlı Hücre Boyama Çözüm Membran Geçirgenlik boya sulandırmak. "Sitotoksisite deneyi" olarak belirlenmiş plaka (lar) her bir çukuruna 50 ul canlı hücre boyama solüsyonu ekleyin. Hücre kültür ortamı çıkarın ve 37 ° C'de,% 5 CO C'de 30 dakika boyunca inkübe DEĞİL <sub> 2. daha sonra karanlıkta oda sıcaklığında 20 dakika boyunca plaka (lar) inkübe yavaşça orta ve boyama çözeltisi aspire ve her bir sabitleme çözeltisi 100 ul / yuva ekleyin. Yavaşça sabitleme çözüm aspirat ve iyi yıkama tamponu / 100 ul ile bir kez yıkayın. Yıkama tamponu çıkarın ve her bir 100 ul / göz 1X permeabilizasyon tamponu ekleyebilir ve karanlıkta, oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edilir. Aspire permeabilizasyon tamponu ve yıkama tabaka iki kez 100 ul / oyuk yıkama tamponu. Aspire tampon ve her bir 1 x bloke edici tampon 100 ul ve karanlıkta, oda sıcaklığında 15 dakika inkübe yıkama. aşağıdaki formüle göre birincil antibodi çözeltisinin yeterli bir hacmi (V) hazırlanması: tampon (ul) V engelleme hacmi = 50 x G 1.2 (kuyu B sayısı) x. Anti-sitokrom C antikoru (fare) 1. seyreltilir: 250 birincil antibodi çözeltisinin içine. Aspire bir bloke edici tamponHer bir oyuğa 50 ul / göz birincil antikor solüsyonu eklenir ve oda sıcaklığında karanlıkta 60 dakika süreyle inkübe d. aşağıdaki formüle göre ikincil Antikor ve Nükleer Çözüm yeterli hacmi (V) hazırlayın: tamponu (ul) V Engelleme Hacmi = 50 x G 1.2 (kuyuların W Sayısı) x. anti-fare antikoru 1 seyreltin: 500 sekonder antikor ve Nükleer Çözüm. Nükleer boya 1 seyreltin: 1,000 İkincil Antikor ve Nükleer Çözüm. Aspire primer antikor çözeltisi ve yıkama plakası 100 | il / göz yıkama tamponu plaka yıkayıcı kullanılarak üç defa. Aspire tamponu ve 50 ul / oyuk sekonder antikor ekleyin ve plaka (lar) her bir oyuğuna Nükleer Çözelti ve karanlıkta, oda sıcaklığında 60 dakika inkübe yıkama. Aspire sekonder antikor ve Nükleer çözümü ve Plakayı 100 | il / göz yıkama tamponu plaka yıkayıcı kullanılarak üç defa. 100 ul / yıkama tamponu da ekleyin. şimdi plaka (lar) (vardır)hazır HCS okuyucu üzerinde değerlendirilmek üzere. DNA Hasarı Testi Yavaşça "DNA hasarını" belirlenen levhalardan orta aspire. – 3.4.2.8 3.4.2.4: izah edildiği gibi aynı aşamaları yerine getirmektedirler. Bu durumda, yalnızca orta aşama 3.4.2.4 sırasında çıkarılan unutmayın. aşağıdaki formüle göre birincil antibodi çözeltisinin yeterli bir hacmi (V) hazırlanması: Bloklama Tamponu hacmi (ul), V = 50 x 1.2 x (kuyu B sayısı) W, Anti-fosfo H2AX antikoru (fare) 1. seyreltilir: Primer antikor çözeltisi 2.000. 3.4.2.10 tarif edildiği gibi aynı adımı gerçekleştirir. aşağıdaki formüle göre ikincil antikor Nükleer eriyiğin yeterli bir hacmi (V) hazırlanması: Bloklama Tamponu hacmi (ul), V = 50 x 1.2 x (kuyu B sayısı) W, anti-fare antikoru 1 seyreltin: 500 sekonder antikor ve Nükleer Çözüm. Nuclea seyreltinr boya 1: İkincil Antikor ve Nükleer Çözüm 1.000. dizisinde tarif edildiği gibi aynı adımları: 3.4.2.12-3.4.2.14. Stres Kinaz Deneyi Yavaşça "Stres Kinaz" belirlenen plakaların her birinden orta aspire. – 3.4.2.8 3.4.2.4: izah edildiği gibi aynı aşamaları yerine getirmektedirler. Bu durumda, yalnızca orta aşama 3.4.2.4 sırasında çıkarılan unutmayın. aşağıdaki formüle göre birincil antibodi çözeltisinin yeterli bir hacmi (V) hazırlanması: Bloklama Tamponu hacmi (ul), V = 50 x 1.2 x (kuyu B sayısı) W, Anti-fosfo antikoru, cJun (tavşan) 1 seyreltin: 200 birincil antibodi çözeltisinin içine. 3.4.2.10 tarif edildiği gibi aynı adımı gerçekleştirir. aşağıdaki formüle göre ikincil antikor Nükleer eriyiğin yeterli bir hacmi (V) hazırlanması: Bloklama Tamponu hacmi (ul), V = 50 x 1.2 x (kuyu B sayısı) W, anti-tavşan antikoru 1 seyreltin: 500 sekonder antikor ve Nükleer Çözüm. Nükleer boya 1 seyreltin: 1,000 İkincil Antikor ve Nükleer Çözüm. dizisinde tarif edildiği gibi aynı adımları: 3.4.2.12-3.4.2.14. ROS Deneyi aşağıdaki formüle göre Canlı Hücre Boyama Çözüm yeterli hacmi (V) hazırlayın: Orta (ul) V hacmi = 50 x G 1.2 (kuyuların W Sayısı) x. satıcı talimatına göre Canlı Hücre Boyama Çözüm ROS boya seyreltin Nükleer boya 1 seyreltin: 1,000 Canlı Hücre Boyama Solution.3.4.5.4 olarak) "ROS" belirlenen her kuyucuğu 50 ul Canlı Hücre Boyama Çözüm ekleyin; hücre kültürü ortamını çıkarın ve karanlıkta, oda sıcaklığında 30 dakika inkübe DEĞİL. Yavaşça orta ve boyama çözeltisi aspire ve 100 ul / oyuk, orta plaka, üç kez yıkayın. _ 100 eklemek, orta aspire6 L / oyuk sabitleme her oyuğa çözeltisi ve karanlıkta, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca plaka inkübe edin. Yavaşça sabitleme çözüm aspirat ve iyi yıkama tamponu / 100 ul plaka üç kez yıkayın. 100 ul / yuva yıkama tamponu ilave edin. Plakası (ler) artık hazır (vardır). 1 saat içinde HCS okuyucu üzerinde plaka değerlendirin. GSH miktar tayini aşağıdaki formüle göre Canlı Hücre Nükleer Boyama Çözüm yeterli hacmi (V) hazırlayın: Orta (ul) V hacmi = 50 x G 1.2 (kuyuların W Sayısı) x. 1000 Canlı Hücre Nükleer Boyama Solution.3.4.6.3 olarak): Nükleer boya (Uzak Kırmızı) 1 seyreltin. "GSH içeriği" belirlenen plakaların her kuyuya Canlı Hücre Nükleer Boyama Çözüm 50 ul ekleyin. Hücre kültürü ortamını çıkarın ve 37 ° C'de,% 5 CO2 seviyesinde 30 dakika inkübe DEĞİL. göre Canlı Hücre GSH Boyama Çözüm yeterli hacmi (V) hazırlayınAşağıdaki formül: HBSS hacmi (ul) V = 50 x 1.2 x (kuyuların W sayısı) W satıcının talimatlarına göre Canlı Hücre GSH Boyama Çözüm GSH boya sulandırmak. Yavaşça orta ve nükleer boyama çözeltisi aspire ve 100 ul / oyuk, orta plaka, üç kez yıkayın. Aspire orta ve plaka (lar) her bir 100 ul / oyuk canlı hücre GSH boyama solüsyonu ekleyin. karanlıkta, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. Plakası (ler) artık hazır (vardır). 1 saat içinde HCS Reader plaka (lar) değerlendirin. Apoptosis denemesi aşağıdaki formüle göre Canlı Hücre Boyama Çözüm yeterli hacmi (V) hazırlayın: Orta (ul) V hacmi = 50 x G 1.2 (kuyuların W Sayısı) x. Kaspaz boya 1 seyreltin: 300 Canlı Hücre Boyama Çözüm. Hücre kültürü ortamları çıkarın t, her sıra için 50 ul canlı hücre boyama çözeltisini ekleyino plaka (lar) "Apoptoz" belirlenmiş ve 37 ° C'de 30 dakika inkübe edilir,% 5 CO2. aşağıdaki formüle göre Canlı Hücre Nükleer Boyama Çözüm yeterli hacmi (V) hazırlayın: Fix çözümü (ul) V hacmi = 50 x G 1.2 (kuyuların W Sayısı) x. Nükleer boya 1 seyreltin: 1,000 Canlı Hücre Nükleer Boyama Çözüm. Canlı hücre boyama çözeltisini çıkarın plaka (lar) her bir kuyu için 100 ul / oyuk canlı hücre nükleer boyama solüsyonu eklenir ve oda sıcaklığında karanlıkta 30 dakika boyunca inkübe edin. sabitleyici / çekirdek boya çözeltisini aspire ve yıkama plakası (ler), 100 ul / yuva yıkama tamponu ile üç kez. 100 ul / yuva yıkama tamponu ilave edin. Plakası (ler) artık hazır (vardır). HCS okuyucusu üzerinde plaka (lar) değerlendirin. Veri Analizi HCS excel (.xls) dosyası olarak ihracat ham veriler. Not: Ham hücre endeks değerleri, 96 gözlü bir biçimde düzenlenir(Yansıtma plaka kuyu dağılımı) de ve belirli bir zaman noktası sonrası dozlama her uç noktaları verilmektedir. aşağıdaki denklem kullanılarak değerlerini normalize: nerede ben bir kuyunun ölçülen ham sinyal değeri, Araç, bir plaka üzerinde, araç kuyuları için ölçülen sinyal değerlerinin ortanca olan Veya aracı (% 0) için arzu edilen ortalama normalize değeri, ve SC, pozitif kontroller (100) için istenen medyan normalleştirilmiş değeri NOT: Bu aşamanın sonunda, bir veri kümesi pozisyonda yer alan örnek uygulanmıştır 96 oyuklu bir plaka içerisinde her bir pozisyonda I, (logaritmik birimi olarak) konsantrasyon Cı için, içeren elde edilen / oyuk I ve onun normalize sinyal N (I) 'e karşılık gelir. Arsa ve uygun (c I, n (i)) – 4-parametreleri Hill denklemi kullanılarak değerler. nerede test bileşiği sıfır konsantrasyonunda Sıfır Etkinlik S 0 = Etkinlik düzeyi, Sonsuz konsantrasyonda sonsuz Etkinlik S inf = Etkinlik düzeyi, Etkinlik maksimum seviyenin% 50 ulaştığı AC50 = Konsantrasyon, Hill katsayısı n = AC50 de yamaç Tedbir ve Doz-tepki eğrisi çizilir x-ekseni üzerindeki değerler karşılık gelen logaritmik birimleri c = konsantrasyon. Not: AC50 düşük değerler, yüksek kuvvetini gösterir tesirliliğinin bir ölçüsüdür.