有害と潜在的に有害な成分の毒性効果を評価するためにハイコンテントスクリーニング分析（HPHC）

1.収穫正常ヒト気管支上皮細胞（NHBEs） 細胞培養培地を、予め温め（気管支上皮細胞成長培地補充培地）、HEPES、トリプシンおよびトリプシン中和溶液（TNS）37℃の水浴です。 コンフルエンスの80％に達した時に細胞を採取。 注：以下のNHBE細胞培養播種条件培地20mlでコーティングされていないT75フラスコ中で最適なコンフルエンスを得るために使用されてもよいです。 種子1×10 3日間の培養のために6個の細胞、0.5×10 4日間の培養のために6個の細胞と5日間の培養のために0.25×10 6細胞。細胞が栄養をリフレッシュするために培養中にあるときに2日ごとに培地に変更します。培養37℃で細胞を、5％CO 2。 フラスコ（複数可）からの上清を除去し、細胞を洗浄するためにHEPESを追加します（ 例えば 、75cm 2のフラスコのための3ミリリットル）。 HEPESゾルと細胞単層をカバーするために各フラスコを回転させますution。 HEPES溶液を除去し、トリプシン溶液を追加します（ 例えば 、75cm 2のフラスコのための3ミリリットル）。トリプシン溶液で細胞単層をカバーするために、フラスコを回転させます。 37±2℃で5分間フラスコをインキュベートします。顕微鏡下で細胞の剥離を監視し、必要に応じて、より長くインキュベートし、穏やかに残っている接着細胞を解放するために、フラスコをタップします。 反応を停止するTNSを追加する（ 例えば 、75cm 2のフラスコ3 ml）及び15 mlチューブに細胞懸濁液を移します。 5分間、300×gで細胞懸濁液を遠心します。 上清を廃棄し、均一な細胞懸濁液を得るために穏やかに混合し、新鮮な培地10mlに細胞ペレットを再懸濁します。 凝集物を除去し、細胞をカウントするために100μMのセルストレーナーを介して細胞懸濁液をフィルタリングします。注：我々の研究室では、電界のマルチチャンネル細胞計数システムを正確かつ一貫viablを評価するために使用しました。E細胞の数。 2.リアルタイムセルアナライザー（RTCA）は線量測距（DRF）ベース注：1）2）を選択した化合物をさらにHCSによって調査されるように、化合物の毒性を評価し、3）HCSのための適切な用量を選択：インピーダンスに基づく測定システムをするために使用されました。 RCTAプレート中のNHBE細胞を、各ウェルに100μlの培地中に存在する試験化合物の希釈液を25μl添加することにより、投与されています。したがって、すべての試験溶液を、5倍（5X）、所望の最終濃度で調製されます。 NHBE細胞を播種 インピーダンス測定の回数と期間を定義するための機器をプログラムします。この研究では、データは48時間15分ごとに記録した（24時間の±2時間前および試験薬剤を細胞に投与後24時間）。 96ウェルRTCAプレートの各ウェルに予め温めておいた50μlの培地をピペットでプレートの背景を測定します。注：このステップは、技術的な要件を表し次いで、細胞ベースの計算のためのベースライン基準として使用される媒体の電気抵抗値を計算するための機器。 50μL/ウェル媒体の既に機器背景で添加したRTCAプレートの各ウェルに（7,200細胞/ウェル）を144000細胞/ ml（±5％）の濃度で細胞懸濁液を調製し、50μlの細胞懸濁液を追加測定。 細胞は（細胞の均一な分布を改善するために）RTCAクレードルにそれらを配置する前に室温で30分間付着してみましょう。インキュベーター（37℃、5％のCO 2）でRTCAクレードルでRTCAプレートをインキュベートし、投与前、次の24±2時間のデータの記録を開始。 HPHCsおよび陽性対照の希釈 陽性コントロール希釈 スタウロスポリンストック溶液（10 mM）のDMSOで1:10に希釈し（ 表3参照）及びdの5μlを添加します培地195μlのにilutionは5倍ワーキング溶液を得ました。 HPHC希釈 溶解/ 1 Mのストック溶液を生成するために、車両（ 表2）の各HPHCを希釈します。 100mMの溶液を生成するために、媒体の各HPHCストック溶液を1:10に希釈します。 5倍ワーキングソリューション（ 図2）を得るために培地+ 10％の車両を使用して、5つのステップ1:10連続希釈を行うことにより、「化合物のマスタープレート」を生成します。注：最終的には、最終的な投与量は次のようになります。0.2μM、2μM、20μM、0.2 mMの、2 mMの、20 mMの。また、このステップでは、唯一の車両に対応し、用量0を準備します。 投薬 RTCA機器を一時停止し、プレートを除去するためのクレードルを開きます。 プレートを取り外し、RTCAプレート温度ツールに入れてください（RTCA外実験手順の間、RTCAプレートの温度を安定させるために設計されましたインピーダンス測定に影響を与える可能性の細胞を、冷却避けるために駅）。 化合物のマスタープレート（行番号7の一番上の行と車両制御における最高用量）（ 図2）と同様の投与順序を維持する三連で細胞に「化合物のマスタープレート」から25μlの5倍溶液を加えます。既存の（100μl）を細胞培養培地を削除しないでください。 既存の培地を除去することなく、一番下の行（ハーフ右）中の細胞に25μlの5倍ポジティブコントロールソリューションを追加します。既存の細胞培養培地を除去することなく、一番下の行（ハーフ左）で細胞に25μlの培地を加えます。 プレートシーラーでプレートをシール。バックRTCAクレードルでプレートを置き、それをロックします。データは、所望の露光時間を記録する再起動（ 例えば 、24時間）。注：このシーラントフィルムの使用は、ウェル間の交差汚染を含む潜在的な汚染を避けることをお勧めします。 <強い>データ解析RTCAとLD 50の計算テキスト（.txt）またはExcel（.XLS）ファイルとしてエクスポートした生データ。注：ファイルは、プレートレイアウト（化合物、用量およびウェル位置）に関するすべての情報が含まれています。生細胞指数値を、96ウェル形式（ミラープレートウェル分布）に編成され、記録が発生したすべての時点のために提供されます。時刻tで、96ウェルプレート中の位置iにおける値は、CIのT（I）で表されます。 私は、私は位置に23時間50分00秒で96ウェルプレート（例えば 、セルインデックス内の各位置のために投与する前に、最新の時点の正規化の基準として特定し、CIのトン （ⅰ）= 23：50：00 = CI 文献 （i））を。注：投薬が行われた場合、この情報は注釈を付けなければなりません。 除算は、ウェルベースで、正規化基準によってあらゆる時点値は、投与時にすべての値を正規化します。 positioで正規化した値時刻tで、96ウェルプレート中のNiは、NCI T（I）で表され、したがって、すべてのtについてNCI tの（I）= CI tの（I）/ CI REF（i）で定義されます。 24時間の時点で曲線下面積（AUC）を計算し、陽性対照および車両の位置を含む、（96ウェルプレート内の位置ⅰ）各サンプルiについて投薬後。 iは各長方形の面積を合計することによって得られる位置でAUCを取得し、2時点間にある各矩形はトンkとトンのリットル （T K <トンリットル ）で表されます。 2時点（Y =（NCIのTK（I）+ NCIのTL（I））の活性の平均である2時点とyの間の距離であるT K -のx =トンのリットルでのx * yを使用して、各矩形領域を計算/ 2）。 注：私は、AUC（I）で表される位置のための24時間後の投与でAUC。すべての条件は、三つ組のウェルに播種されたように3つの値の中央値が​​使用されます。 <LI>次の式を使用して値を正規化： ここで、iは 、AUCは24時間後の投与で計算された96ウェルプレート内の位置です 車両は 、24時間の投与後にプレート上の車両ウェルのAUC値の中央値であります 陽性対照は 、24時間の投与後にプレート上の陽性対照ウェルのAUC値の中央値であります CRは、車両（0％）のための所望の中央値正規化された値であり、かつ SCは、陽性対照のための所望の中央値正規化した値である（-100％） 注：このステップの終了時に、データセットは、96ウェルプレートの各位置iについて、含まれているが得られる、（対数単位）の濃度CI位置/ウェルiとその対応に含まれるサンプルに適用されます24時間後に投与AUC_normalizで正規化されたAUCED（I）。 プロットとフィット（ 私は 、AUC_normalized（i）は、C）の4パラメータHill式を使用して-値。可能な場合、また、LD 50を計算します。 ここで、Y = AUC_normalized、 試験化合物の濃度ゼロでゼロ活動S 0 =活動レベル、 無限濃度で無限の活動S INF =活動レベル、 活性は最大レベルの50％に達するAC50 =濃度、 ヒル係数のn = AC50における傾きの測定、および C =用量反応曲線のプロットのx軸上の値に対応する対数単位で濃度。 注：AC50は、LD 50（細胞傷害性アッセイ）に相当します。これは、低い値は、高い効力を示す効力の尺度です。 3. HCSによって毒性作用を測定します注：6の異なるアッセイでグループ化された毒性九マルチパラメトリックマーカーの合計は、HCSプラットフォーム（ 表1）を用いて測定されます。 RTCA細胞生存率分析（セクシ​​ョン2）に基づいて、各成分の用量範囲が定義され、3R4F参照量も含まれます。参照用量は、基準シガレット3R4Fから1スティックの煙中HPHCの存在量に相当します。 NHBE細胞を播種 （12,000細胞/ウェル）12万細胞/ ml（±5％）で細胞懸濁液を調製し、96ウェルHCSプレートの各ウェルに100μlの細胞懸濁液を加えます。すべてのアッセイ（細胞毒性、DNA損傷、ストレスキナーゼ、ROS、GSH含量とアポトーシス）と時点（4および24時間）の評価のために十分なプレートを準備します。 細胞がウェルに付着し、その後3でインキュベートすることを可能にするために30分間室温でHCSプレートを残します7°Cおよび投与前に24±2時間、5％CO 2。 HCHPsおよび陽性対照の希釈 注：HCSプレート中NHBE細胞は、各ウェル中に既に存在する培地100μlに、試験試料溶液を25μl添加することによって投与されます。したがって、すべての用量は5×所望の最終濃度で調製されます。 ポジティブコントロールの希釈（ポジティブコントロールプレート） 各ポジティブコントロールのストック溶液40μlを分注し、カラム＃2（ 図4a、赤で斜線のウェル）中の（ 表 3参照）。列＃3、＃5（ 図4a、水色で網掛けのウェル）とカラム＃4の車両の40μlの（ 図4a、水色で網掛けのウェル）で車両の20μLを分注します。 、カラム＃2のウェルから12μlのを撤回コラム＃3のウェルにそれを分配し、混合する（ 図4b）、得られた各陽性対照化合物（ 図4c）のための3つの用量（D1、D2、およびD3）と車両（V）との最終連続希釈まで続けます。ポジティブコントロールプレートを生成するには、メディア（ 図4d）中の化合物の1：40希釈を準備します。 HPHC希釈（化合物マスタープレート） 注：HCSのためのHPHCsの選択された用量範囲は、表2に記載されています。 100 mMの濃度のために各HPHCストック溶液（1 M）培地中で1:10に希釈します。各HPHCのために選択された5倍の用量を得るために、10％の車両で培地を用いて希釈を行います。 投薬 化合物のマスタープレート（行番号7の一番上の行と車両制御における最高用量）（ 図5）と同様の投与順序を維持する三連で細胞に化合物マスタープレートから5倍のソリューションの25μlのを追加します。電子メールを削除しないでくださいxisting（100μl）を細胞培養培地。 ポジティブコントロールプレート（ 図5）と同様の投与順序を維持する一番下の行のセルにポジティブコントロールプレートから5倍溶液25μlを追加します。既存の（100μl）を細胞培養培地を削除しないでください。注：各アッセイは、特定の陽性コントロールを持っています。 表3は、所望の露光時間（4もしくは24時間）、37℃、5％CO 2でプレートをインキュベート参照。 染色 すべてのアッセイのための準備 37℃での洗浄緩衝液（PBS）ソリューションを事前に温めます。 37℃での洗浄バッファーとプリ暖かいそれの89.19ミリリットルに10.81ミリリットルのホルムアルデヒド37％を追加する固定液（4％ホルムアルデヒド溶液）を準備します。 洗浄緩衝液90 mlに10倍透過化緩衝液10mlを添加することにより、透過化緩衝液を調製し、37℃で、それを事前に温め。 BLOを準備37℃での洗浄バッファーとプリ暖かいそれの90ミリリットルにブロッキング緩衝液10倍の10ミリリットルを追加することで弄ぶ天使バッファ。 37℃で細胞培養培地を、予め温め。 4と24時間の露光時間に達した後にインキュベーターからHCSプレートを取り外し、各アッセイのために、次の特定のプロトコルを実行します。 細胞毒性分析 次の式に従って生細胞染色溶液の十分な体積（V）を準備します。媒体の体積（μL）V = 50×幅×1.2（井戸のW数） ベンダーの指示に従って、生細胞染色液にミトコンドリア染料を希釈します。ベンダーの指示に従って、生細胞染色液に膜透過性色素を希釈します。 「細胞毒性アッセイ」と称さプレート（複数可）の各ウェルに50μlのライブ細胞染色液を追加します。細胞培養培地を除去し、37℃、5％COで30分間インキュベートしないでください<suB> 2。 静かに培地及び染色液を吸引し、各ウェルに固定液の100μl/ウェルを追加し、その後、暗所で室温で20分間プレート（複数可）をインキュベートします。 静かに固定液を吸引し、洗浄緩衝液100μl/ウェルで一回洗浄します。 洗浄バッファーを削除し、各ウェルに100μl/ウェルの1×透過化バッファを追加し、暗所で室温で10分間インキュベートします。 吸引透過性バッファーおよび100μl/ウェルの洗浄緩衝液で2回プレートを洗浄します。 吸引除去は、バッファと、各ウェルに1×ブロッキング緩衝液100μlを加え、室温、暗所で15分間インキュベートウォッシュ。 次の式に従って一次抗体液の十分な体積（V）を準備します。ブロッキング緩衝液の容量（μL）V = 50×幅×1.2（井戸のW数）。一次抗体溶液中で250：抗チトクロムC抗体（マウス）1に希釈します。 吸引しブロッキング緩衝液Dを各ウェルに50μlの/ウェルの一次抗体液を追加し、暗所で室温で60分間インキュベートします。 次の式に従って二次抗体と原子力ソリューションの十分な体積（V）を準備します。ブロッキング緩衝液の容量（μL）V = 50×幅×1.2（井戸のW数）。二次抗体と原子力ソリューションで500：抗マウス抗体1を希釈します。二次抗体と原子力ソリューション1,000：核染料1に希釈します。 吸引し一次抗体液とプレートウォッシャーを使用して洗浄緩衝液の100μl/ウェルでプレートを3回洗浄します。 吸引し、洗浄緩衝液とプレート（複数可）の各ウェルに50μlの/ウェルの二次抗体と原子力ソリューションのを追加し、暗所で室温で60分間インキュベートします。 吸引し二次抗体と原子力ソリューションとプレートウォッシャーを使用して洗浄緩衝液の100μl/ウェルでプレートを3回洗浄します。洗浄バッファーの100μl/ウェルを追加します。今プレート（複数可）（ある）されていますHCSリーダー上で評価される準備ができて。 DNA損傷アッセイ 静かに「DNA損傷」と称さプレートから培地を吸引除去します。 順番に説明したのと同じ手順を実行します。3.4.2.4 – 3.4.2.8を。この例では、唯一の媒体がステップ3.4.2.4中に除去されることに注意してください。 次の式に従って一次抗体液の十分な体積（V）を準備します。ブロッキング緩衝液の容量（μL）V = 50×幅×1.2（井戸のW数） 抗ホスホH2AX抗体を希釈（マウス）1：一次抗体溶液中での2000。 3.4.2.10で説明したのと同じ手順を実行します。 次の式に従って二次抗体と原子力ソリューションの十分な体積（V）を準備します。ブロッキング緩衝液の容量（μL）V = 50×幅×1.2（井戸のW数） 二次抗体と原子力ソリューションで500：抗マウス抗体1を希釈します。 Nucleaを希釈R染料1：二次抗体と原子力ソリューションで千。 3.4.2.12-3.4.2.14：順序で説明したのと同じ手順を実行します。 ストレスキナーゼアッセイ 静かに「ストレスキナーゼ」指定の各プレートから培地を吸引除去します。 順番に説明したのと同じ手順を実行します。3.4.2.4 – 3.4.2.8を。この例では、唯一の媒体がステップ3.4.2.4中に除去されることに注意してください。 次の式に従って一次抗体液の十分な体積（V）を準備します。ブロッキング緩衝液の容量（μL）V = 50×幅×1.2（井戸のW数） 抗リン酸化cJun抗体を希釈（ウサギ）1：一次抗体液で200。 3.4.2.10で説明したのと同じ手順を実行します。 次の式に従って二次抗体と原子力ソリューションの十分な体積（V）を準備します。ブロッキング緩衝液の容量（μL）V = 50×幅×1.2（井戸のW数） 二次抗体と原子力ソリューションで500：抗ウサギ抗体1を希釈します。 二次抗体と原子力ソリューション1,000：核染料1に希釈します。 3.4.2.12-3.4.2.14：順序で説明したのと同じ手順を実行します。 ROSアッセイ 次の式に従って生細胞染色溶液の十分な体積（V）を準備します。媒体の体積（μL）V = 50×幅×1.2（井戸のW数）。 ベンダーの指示に従って生細胞染色溶液中のROS染料を希釈原子力染料1希釈：ライブ細胞染色Solution.3.4.5.4 1,000）」をROS」指定された各ウェルプレートに50μlの生細胞染色溶液を追加します。細胞培養培地を除去し、暗所で室温で30分間インキュベートしないでください。 静かに培地及び染色液を吸引し、100μl/ウェルの培地で3回プレートを洗浄します。 _ 100を追加し、培地を吸引6;各ウェルにリットル/ウェルの固定液、暗所で室温で20分間静置します。 静かに固定液を吸引し、洗浄緩衝液100μl/ウェルで3回プレートを洗浄します。 100μl/ウェルの洗浄バッファを追加します。プレート（複数可）は、準​​備ができました（しています）。 1時間以内にHCSリーダー上でプレートを評価します。 GSHコンテンツアッセイ 次の式に従ってライブ細胞核染色溶液の十分な体積（V）を準備します。媒体の体積（μL）V = 50×幅×1.2（井戸のW数）。 生細胞核染色Solution.3.4.6.3 1,000）：核染料（遠赤）1に希釈します。 「GSHコンテンツ「指定プレートの各ウェルにライブ細胞核染色溶液の50μLを加えます。細胞培養培地を除去し、37℃、5％CO 2で30分間インキュベートしないでください。 に従って生細胞GSH染色溶液の十分な体積（V）を準備以下の式：HBSSの容量（μL）V = 50×幅×1.2（井戸のW数） ベンダーの指示に従って、ライブセルGSH染色溶液にGSH染料を希釈します。 ゆっくり媒体及び核染色液を吸引し、100μl/ウェルの培地でプレートを3回洗浄します。 培地を吸引し、プレート（複数可）の各ウェルに100μl/ウェルの生細胞のGSH染色溶液を追加します。 暗所で室温で10分間インキュベートします。プレート（複数可）は、準​​備ができました（しています）。 1時間以内にHCSリーダー上のプレート（複数可）を評価します。 アポトーシスアッセイ 次の式に従って生細胞染色溶液の十分な体積（V）を準備します。媒体の体積（μL）V = 50×幅×1.2（井戸のW数）。 生細胞染色溶液に300：カスパーゼ色素1を希釈します。 細胞培養培地を取り除き、トンの各ウェルに50μlの生細胞染色溶液を追加彼は、プレート（複数可）、「アポトーシス」と指定され、37°C、5％CO 2で30分間インキュベートします。 次の式に従ってライブ細胞核染色溶液の十分な体積（V）を準備します。修正液の容量（μL）V = 50×幅×1.2（井戸のW数）。 ライブ細胞核染色溶液で千：核染料1に希釈します。 、生細胞染色溶液を除去し、プレート（複数可）の各ウェルに100μl/ウェルのライブ細胞核染色溶液を添加し、暗所で室温で30分間インキュベートします。 固定剤/核色素溶液を吸引し、洗浄プレート（複数可）を100μl/ウェルの洗浄緩衝液で3回。 100μl/ウェルの洗浄バッファを追加します。プレート（複数可）は、準​​備ができました（しています）。 HCSリーダー上でプレート（複数可）を評価します。 データ分析HCS エクセル（.XLS）ファイルとしてエクスポートした生データ。注：生細胞の指標値は、96ウェル形式で編成され（ミラープレートウェル分布）において、所定の時点、投与後に、すべてのエンドポイントのために提供されます。 次の式を使用して値を正規化： ここで、iは 、井戸の測定された生信号値であり、 車両は 、プレート上の車両のウェルについて測定された信号値の中央値であります CRは、車両（0％）のための所望の中央値正規化された値であり、かつ SCは、陽性対照（100）のための所望の中央値正規化された値であり、 注：このステップの終わりには、データセットは、96ウェルプレートの各位置iについて、含まれているが得られる、濃度c iが （対数単位）の位置/ウェルiと ​​その中に含まれるサンプルに適用し、正規化された信号のN（i）に対応します。 4パラメータHill式を使用して値- （I：C、N（I））をプロットし、フィット。 ここで、試験化合物の濃度ゼロでゼロ活動S 0 =活動レベル、 無限濃度で無限の活動S INF =活動レベル、 活性は最大レベルの50％に達するAC50 =濃度、 ヒル係数のn = AC50における傾きの測定、および C =用量反応曲線のプロットのx軸上の値に対応する対数単位で濃度。 注：AC50は低い値が高い効力を示す効力の尺度です。