ניתוח הקרנת תכולה גבוהה כדי להעריך את ההשפעות טוקסיקולוגי של מזיקים מזיקים מרכיבים (HPHC)
Summary
The objective of the study was to assess the biological impact of 15 cigarette smoke constituents using a combination of an impedance-based real time cell analyzer and a high-content screening (HCS)-based platform for toxicological assessment in vitro. This study provides information on effective doses, toxicity and modes of action of the tested compounds.
Abstract
עשן סיגריות (CS) הוא גורם סיכון עיקרי למחלות לב וכלי דם וסרטן הריאות. בגלל CS הוא תרסיס מורכב המכיל יותר מ -7,000 כימיקלים 1 זה אתגר להעריך את התרומה של מרכיבים בודדים לרעילות הכוללת שלה. פרופילים טוקסיקולוגי של מרכיבים בודדים, כמו גם תערובות ניתן לקבוע זאת במבחנה, על ידי החלת גבוהה דרך-לשים כלי האיתור, המאפשרים יצירת פרופיל של מרכיבים מזיקים מזיקים (HPHCs) של עשן טבק, כפי שהוגדר על ידי המזון והתרופות מנהל (FDA). 2
לקבלת הערכה ראשונית, מכשיר עכבה המבוססת שמש הערכה בזמן אמת, ללא תווית של הרעילות המתחמת. על צג המכשיר מסתמך על הידבקות תא, כדאיות ומורפולוגיה שכל יחד לספק סקירה של מצב התא. פרמטר מימדים, בשם מדד תא, משמש כימות. סט של DIFפרוטוקולים מכתים ferent פותחה עבור חקירה מבוסס דימות פלואורסצנטי ופלטפורמה HCS שימש כדי לקבל מידע מעמיק יותר על סוג של רעילות שהושרו על-ידי כל HPHC.
של 15 המרכיבים שנבדקו, רק חמישה נבחרו לניתוח מבוססי HCS כפי שהם רשמו LD חשיב 50 (<20 מ"מ). אלה כללו 1-aminonaphtalene, ארסן (V), כרום (VI), Crotonaldehyde ו פנול. בהתבסס על והשפעתם HCS, 1-aminonaphtalene ו פנול ניתן היה לזהות לגרום תפקוד המיטוכונדריה, ויחד עם כרום (VI) כמו genotoxic מבוסס על זירחון H2AX היסטון מוגברת. Crotonaldehyde זוהה כקובץ inducer סטרס חמצוני ארסן בתור מפעיל מסלול קינאז מתח.
מחקר זה מוכיח כי שילוב של טכנולוגיות HCS מבוססי עכבה מספק כלי חזק להערכה במבחנה של מרכיבי CS.
Introduction
הערכת סיכוני טוקסיקולוגי הסתמכה הסטורית על השימוש במודלים של בעלי חיים אשר, אם כי יסוד בתחום מדעי החיים, מקושר גם עם מכשולים כגון translatability העקבי לבני אדם עלות גבוהה. יתר על כן, חל במאמץ להגדיל למצוא חלופות לניסויים בבעלי חיים ברוח של "3Rs" 2 (תחליף, הפחתה, ועידון). מאמץ זה הואץ במהלך השנים האחרונות, לא רק הודות לפיתוחים חדשים כגון טכניקות תפוקה גבוהה וגישות ביולוגיה של מערכות, אלא גם בגלל החקיקה להגביל את השימוש של ניסויים בבעלי חיים, במיוחד באיחוד האירופי.
המורכבות של מסלולים הסלולר איתות הסדרה בתגובת עלבונות רעילים עושות את זה ברור כי באמצעות נקודות קצה טוקסיקולוגית יחידות לא יספיק כדי לתאר את הבסיס טוקסיקולוגית של תרכובות מסוימות. לשם כך, את יחסי הגומלין של מאות אינטראקציה proteins תורם לרשת ביולוגית גם צריך להילקח בחשבון. כדי לחקור את ההשפעה של toxicants ברשתות אלה, גישת טוקסיקולוגיה מערכת בשילוב עם גוף בינוני פנוטיפי מבחני תפוקה גבוהה הקרנה כדאי להסיק חוזקים ובאותו הזמן לספק מידע נוסף על מנגנון הפעולה של toxicants פרט.
במחקר זה, אנחנו עובדים HCS ככלי מיון עצמה, אשר מורכב של מיקרוסקופ אוטומטית יישום תוכנה ביולוגי, שיכול לרכוש, לעבד ולנתח נתוני תמונה נגזרו מבחני הסלולר קרינה מבוססת ספציפיים. זה מאפשר שינויים חזותיים בתוך תא שיש לכמת, בכל תא בודד או ברמת subcellular, ופרמטרים רבים להיות מנותח בו זמנית. 3 לדוגמה, הדנ"א הכפול גדיל הפסקות הוערכו באמצעות זיהוי מבוסס נוגדן של זירחון H2AX היסטון ו (reactive oxygen species ROS) היה לכמת באמצעות א-פרם תאלצבוע eable דיסמוטאז רגיש.
מכיוון שתאי האפיתל ריאות לייצג את המחסום הביולוגי הראשון נגד toxicants בשאיפה, כוללים עשן סיגריות, השתמשנו תאי אפיתל סימפונות עיקריים כמודל במבחנה לפרופיל השפעת HPHCs שפורסם על ידי מנהל המזון והתרופות בארצות הברית. 4 כתב יד זה הוא המשך -up על מחקר קודם 5 שבו הערכנו את ההשפעה הביולוגית של קבוצת משנה שונה של HPHCs.
במסגרת העבודה שלנו להעריך cytotoxicity במבחנה, בתחילה החוקרים העריכו את החוזקים של מבחר של 15 HPHC של, באמצעות ניתוח הסלולר עכבה מבוססת בזמן אמת (RTCA) מערכת אשר אפשרה לנו להקים מנה-טווחים, מתאימים עוקבת HCS ניתוח (איור 1). הערכה HCS טוקסיקולוגית נערך מכן באמצעות תשע נקודות קצה רב-פרמטרית של רעילות הסלולר, כל פיקוח בשתי נקודות זמן (4 ו -24 שעות). סמני השתמשו היו מעיד על רעילות המיטוכונדריה, נזק לדנ"א, קינאז מתח, (reactive oxygen species ROS), גלוטתיון (GSH) תוכן, caspase 3 – פעילות 7, שחרור C ציטוכרום וחדירות קרום התא, כמתואר בטבלה 1.
הגישה המופעלת שלנו זיהוי ואפיון של השפעת המרכיבים עשן סיגריות דרך דגימת dose- וזמן תלוי. בסופו של דבר, זה מיוצר פרופיל במבחנה טוקסיקולוגית לכל HPHC. גישות רב-omics יכול לשמש גם כדי להשלים את ניתוח HCS נוספת. זה היה סוף סוף גם לספק הבנה עמוקה יותר של תופעות על איתות התאים ו / או רמת תעתיק.
Protocol
Representative Results
Discussion
הצרכים חלופות לניסויים בבעלי חיים ועל המבחן המתקרב תפוקה גבוהה חדש ניתנת הדעת למכביר במהלך השנים האחרונות. זו הובילה מדענים ורשויות רגולטוריות לחקור שיטות חלופיות לבדיקות רעילות סטנדרטיות, ניצול מבחני הסלולר כי מחקו את הפיסיולוגיה של רקמות יעד. במחקר זה, אנו הוכחנו את הישימות של שילוב מנתח תא בזמן אמת (RTCA) בהקרנה תכולה גבוהה פלטפורמה (HCS) כדי להעריך את ההשפעה של חשיפה לבוחרי CS יחידים על תאי אפיתל הריאה אנושיים. התקנה זו יכולה להיות מיושמת באופן אנלוגי להעריך cytotoxicity המושרה על ידי מזהמים באוויר שונים אחרים, חלקיקים הנישאים באוויר, חלקיקים. יתר על כן, התוצאות שהתקבלו ניתן להתאים עם אלה transcriptomics כולו הגנום ושיטות חישוביות מבוססים על רשתות ביולוגיות סיבתי. כפי שדווח בעבר, גישה זו אפשרה לנו לאשש נתונים על מסלול מולקולריהפרעות בחשיפת CS 5 עם נקודות קצה HCS, פונה הפרעות מסלול אלה גם phenotypically.
כתוצאת assay תרשים זרימה, ניתוח תא בזמן האמת מספק מידע הקשורות כדאי תא בהחלטה dose- וזמן תלוי, המאפשר קבלת החלטות טובה יותר אשר מנה ונקודת זמן חשיפה עשויים להיות חיוביים עבור ניתוח במורד זרם 14. העיקרון של הנתח מסתמך על שינויי העכבה חשמלית שנוצרה על ידי התאים כמו שהם מייחסים ולהתפשט על משטח גם תרבות המכוסה microelectrode זהב. העכבה מומר פרמטר מימדים בשם-מדד תא, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לפקח על הידבקות התא, להפיץ, המורפולוגיה כדאיות התא בסופו של דבר. למרות טכניקה זו אינה מספקת מידע על מנגנוני ציטוטוקסיות, רגישותו מאפשרת זיהוי של שינויים הסלולר מורפולוגיים אפילו במינונים נמוכים מאוד שבו HCS אינו אינפורמטיבי (מידע לא מוצג). בהתבסס על previניסויי יחידות ארגוניים, שציינו כי המתודולוגיה RTCA היא מסוגלת לזהות שינויים מורפולוגיים במינונים נמוכים לעומת קצה HCS.
בעקבות סינון ראשוני עם מנתח התא בזמן אמת, פלטפורמה HCS שימש לצבור מעמיק יותר מידע על סוג של רעילות שהושרו על-ידי כל HPHC. הפאנל assay HCS מותר פרופיל HPHCs כלפי והשפעתם האפשרית על תאים סלולריים / אברונים כמו גם לזהות את אלו לעורר מתח עקה גנטוקסית או חמצוני. הניתוח חשף פרופילים שונים לפיה HPHCs שנבחר לגרום cytotoxicity בתאי NHBE. באופן כללי, כל המתחמים, למעט פנול, נמצאו לגרום נמק בבית המינונים שנבדקו הגבוהה ביותר. עקבי עם תפקיד פוטנציאלי בזירחון מושרה 1-aminonaphtalene התפתחות הסרטן של H2AX כסמן עקה גנטוקסית, אולם בלוח HCS גם הפעילות הלא מכוסה של HPHC זה את ההודעה הרעילה המיטוכונדריה (גדל מונית relea ציטוכרום Cse) ו סטרס חמצוני (דלדול GSH). באופן דומה, כפי שתואר לעיל, זוהה פנול לגרום תפקוד המיטוכונדריה, ולגרום נזק ל- DNA וכן דלדול GSH. כרום (VI), אחד המתחמים המסווגים הקבוצה שאני מסרטן, וכן Crotonaldehyde גם זוהו הן genotoxic, בפרט כרום (VI) גם לאפופטוזיס (הפעלת מפל caspase) ו Crotonaldehyde שנגרמו גדלו דור ROS. לבסוף ארסן (V), נמצא לגרום זירחון cJun אשר מהווה סמן של הפעלת מסלול קינאז המתח.
במחקר זה, השתמשנו תאי NHBE כמודל תאי אפיתל ריאות במבחנה. באמצעות תאים אלה בסביבת HCS הוא חסר תקדים ואפשר חקירת מגוון רחב של נקודות קצה, כוללים סמני עקה גנטוקסית חמצוני לחץ. שני תא חי וגישות מכתים תא קבועות תוארו בתוך הפרוטוקולים שלנו, מדגימים את הגמישות של הטכניקה הכללית. ב fמעשה, הפרוטוקולים עצמו יכול להיות מיושם על מגוון רחב יותר של מטרות, אשר ניתן לטפל על ידי שימוש בכל צבע או נוגדן פלואורסצנטי. עבור הביצוע המוצלח של הפרוטוקולים המכתימים החיים, חשוב לכבד את זמן הדגירה, כמו כמה הצבעים יש זמן מחצית חיים מוגבלים אות הקרינה עלול לגרום לירידה לפני רכישת התמונה הושלמה. כמו כן, חשוב לקחת בחשבון כי אם סוג תאים שונה משמש, כל התנאים המכתימים צריכים להיות הערכה מחדש, כמו הריכוז לצבוע אופטימלית זמן הדגירה עשוי להיות שונה.
במאמר הנוכחי שתיארנו תרחיש שבו רק חמישה מתחמים שבהם הוקרן למתודולוגיה HCS. בהתחשב פריסת הצלחת שתוארה לעיל, הם היו במינון מעל 2 סטי צלחת שונים עבור סכום כולל של 24 צלחות (6 מבחנים ו -2 נקודות זמן) .the מספר הצלחות יכול גם להיות מוגבר, ובכך לאפשר להקרנה סימולטני של תרכובות או יותר investigation של נקודות קצה יותר. לפני שתעשה זאת, אולם יש לקחת בחשבון כי נקודות קצה מסוימות (GSH ו ROS) דורשים לרכישה מיידית, וכתוצאה מכך, את המינון של הצלחות צריכה להתבצע בצורה מדורגת להתיר רכישת הצלחת הקודמת. מצד השני, באמצעות פרוטוקול מכתים תא קבוע מהווה יתרון כמו הצלחות יכולות להיערם, לקטוע את הפרוטוקול בשלב כלשהו לאחר הקיבוע, להשלמת ההליך מכתים בשלב מאוחר יותר. גישה זו, למשל, תספק המפעיל עם הזמן להשלים את כל הצלחות מכתימות תא החיים מבלי להתפשר על איכות הנתונים.
כדי להמשיך לייעל את העבודה על ידי הפחתת מספר הצלחות, זה יהיה גם אפשר זמנית יותר נקודות קצה יחד. כך למשל בשנת נזק ומתח DNA בהקשר זה קינאז יכול להיחקר יחד פשוט באמצעות שני נוגדנים משני עם fluorochromes פולטות ג שוניםhannels. פיתוח מתמשך של פלטפורמת HCS, כולל זריעת תאים אוטומטי לחלוטין, דילול המתחם, מינון והכתים, כמו גם תוספת של נקודות קצה חדשה יהיה להרחיב עוד יותר את היכולת של פלטפורמת HCS ככלי פרופיל רב עוצמה עבור HPHCs על אפיתל סוגי תאים אחרים .
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות Karsta Luettich וגרגורי Vuillaume לבדיקה שלהם של כתב היד.
Materials
| Cellomics ArrayScan VTI HCS Reader | Thermo | N01-0002B | |
| xCelligence RTCA MP | ACEA | 05331625001 | |
| Screener (HCS) | Genedata | NA | |
| CASY counter TTC | Roche | 05 651 719 001 | |
| e-Plates VIEW 96 | ACEA | 06 472 451 001 | |
| RTCA Frame 96 | ACEA | 05232392001 | |
| RTCA Cardio Temperature Tool | ACEA | 2801171 | |
| Plate sealer breathseal | Greiner bio-one | 676051 | |
| Normal Human Bronchial Epithelial cells (NHBE) | Lonza | CC-2540 | non-smoking 60-year-old Caucasian male donor |
| BEGM BulletKit | Lonza | CC-3170 | Warm at 37 °C before use |
| ReagentPack Subculture Reagents kit | Lonza | CC-5034 | Warm at 37 °C before use |
| Penicillin/Streptomycin (100x) | Corning | 30-002-CI | |
| Easy Flask filter cap 75cm2 | Thermo Scientific | 12-565-349 | |
| 96 well assay plate black | Corning | 3603 | |
| Hoechst 33342 | Fisher Scientific | PI-62249 | |
| Draq5 (For Far Red Nuclear Staining) | Biostatus | DR50200 | |
| Mitochondrial Dye: MitoTracker Red CMXRos | Life technologies | M-7512 | |
| Mitochondrial Dye: MitoTracker Red CM-H2XRos | Life technologies | M-7513 | |
| ROS Dye: Dihydroethidium | Sigma | D7008 | |
| ROS Dye: CellROX | Life technologies | C10422 | |
| ROS Dye: MitoSOX | Life technologies | M36008 | |
| GSH Dye: Monochlorobimane | Sigma | 69899 | Toxic |
| GSH Dye: Monobromobimane | Life technologies | M-1378 | Toxic |
| Membrane permeability Dye: YO-PRO-1 | Life technologies | Y3603 | Irritating |
| Membrane permeability Dye: TO-PRO-1 | Life technologies | T3602 | Irritating |
| Membrane permeability Dye: TOTO-1 | Life technologies | T3600 | Irritating |
| Caspase Dye: Cellevent Caspase 3/7 green | Life technologies | C10423 | Irritating |
| Anti-Cytochrome C antibody (Mouse) | Thermo | MA5-11823 | |
| Anti-phospho-c-Jun antibody (Mouse) | Thermo | MA5-15889 | |
| Anti-phospho-H2AX antibody (Mouse) | Thermo | MA1-2022 | |
| Goat anti-Mouse IgG DyLight 650 | Abcam | ab96878 | |
| 10X permeabilization buffer | Fisher | 8408400 | |
| 4% Formaldehyde solution | Sigma | F1635 | Toxic |
| 10X blocking buffer | Fisher | 8408500 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
| Hanks' Balanced Salt solution | Sigma | H8264 | |
| Staurosporine | Sigma | S4400 | Toxic |
| Valinomycin | Sigma | V0627 | Toxic |
| Paraquat | Sigma | 36541 | Toxic |
| Anisomycin | Sigma | A9789 | Toxic |
| Ethacrynic acid | Sigma | E4754 | Toxic |
| 1-Aminonaphthalene | Sigma | 34390 | Toxic |
| 2-Nitropropane | Sigma | 130265 | Toxic |
| Acetamide | Sigma | 695122 | Toxic |
| Acetone | Sigma | 650501 | Toxic |
| Acrylamide | Sigma | A9099 | Toxic |
| Arsenic (V) | Sigma | A6756 | Toxic |
| Benzene | Sigma | 12540 | Toxic |
| Chromium (VI) | Sigma | 216623 | Toxic |
| Crotonaldehyde | Sigma | 262668 | Toxic |
| Methyl ethyl ketone | Sigma | 34861 | Toxic |
| Nickel | Sigma | 203866 | Toxic |
| Nitrobenzene | Sigma | 48547 | Toxic |
| Phenol | Sigma | P5566 | Toxic |
| Quinoline | Sigma | 241571 | Toxic |
| Toluene | Sigma | 34866 | Toxic |
References
- Rodgman, A., Perfetti, T. A. . The chemical components of tobacco and tobacco smoke. , (2013).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. . The Principles of Humane Experimental Technique. , (1959).
- Zock, J. M. Applications of high content screening in life science research combinatorial chemistry & high throughput screening. Comb. Chem. High. Throughput. Screen. 132 (9), 870-876 (2009).
- US Food and Drug Administration. . Harmful and potentially harmful constituents in tobacco products and tobacco smoke; established list, federal register. , 20034-20037 (2012).
- Gonzalez-Suarez, I. Systems Biology Approach for Evaluating the Biological Impact of Environmental Toxicants in Vitro. Chem. Res. Toxicol. 27 (3), 367-376 (2014).
- Camilleri-Broet, S., Vanderwerff, H., Caldwell, E., Hockenbery, D. Distinct alterations in mitochondrial mass and function characterize different models of apoptosis. Exp. Cell. Res. 239 (2), 277-292 (1998).
- Li, P., et al. Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates and apoptotic protease cascade. Cell. 91 (4), 479-489 (1997).
- Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. Double strand breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J. Biol. Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).
- Westwick, J. K., Weitzel, C., Minden, A., Karin, M., Brenner, D. A. Tumor necrosis factor α stimulates AP-1 activity through prolonged activation of the c-jun kinase. J. Biol. Chem. 269 (42), 26396-26401 (1994).
- Bindokas, V. P., Jordán, J., Lee, C. C., Miller, R. J. Superoxide production in rat hippocampal neurons: selective imaging with hydroethidine. J. Neurosci. 16 (4), 1324-1336 (1996).
- Barhoumi, R., Bailey, R. H., Burghardt, R. C. Kinetic analysis of glutathione in anchored cells with monochlorobimane. J. Cytometry. 19 (3), 226-234 (1994).
- Huang, T. C., Lee, J. F., Chen, J. Y. Pardaxin an antimicrobial peptide, triggers caspase-dependent and ROS-mediated apoptosis in HT-1080 Cells. Mar. Drugs. 9 (10), 1995-2009 (2011).
- Bao, S., Knoell, D. L. Zinc modulates cytokine-induced lung epithelial cell barrier permeability. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 291 (6), L1132-L1141 (2006).
- Xia, M., et al. Compound Cytotoxicity Profiling Using Quantitative High-Throughput Screening. Environ Health Perspect. 116 (3), 284-291 (2008).
