High Content Screening Analyse van de toxicologische effecten van schadelijke en potentieel schadelijke bestanddelen Evalueren (HPHC)
Summary
The objective of the study was to assess the biological impact of 15 cigarette smoke constituents using a combination of an impedance-based real time cell analyzer and a high-content screening (HCS)-based platform for toxicological assessment in vitro. This study provides information on effective doses, toxicity and modes of action of the tested compounds.
Abstract
Sigarettenrook (CS) is een belangrijke risicofactor voor hart- en longziekten. Omdat CS is een complex aerosol met meer dan 7.000 chemicaliën 1 het een uitdaging om de bijdragen van de afzonderlijke bestanddelen zijn algemene toxiciteit te beoordelen. Toxicologische profielen van de afzonderlijke onderdelen, alsmede voor mengsels kunnen echter worden vastgesteld in vitro, door het toepassen van high-throughput screening instrumenten, die de profilering van schadelijke en potentieel schadelijke bestanddelen (HPHCs) van tabaksrook mogelijk te maken, zoals gedefinieerd door de Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA). 2
Voor een eerste beoordeling, werd een impedantie gebaseerde instrument gebruikt voor een real-time, label-free beoordeling van de toxiciteit van de verbinding. Het instrument uitlezing is gebaseerd op celadhesie, leefbaarheid en morfologie dat allemaal bij elkaar geven een overzicht van de status cel. Een dimensieloze parameter genaamd cel index wordt gebruikt voor kwantificering. Een set van diflende kleuring protocollen ontwikkeld voor fluorescentie beeldvorming gebaseerd onderzoek en een HCS platform werd gebruikt om meer gedetailleerde informatie over de aard van cytotoxiciteit opgewekt door elke HPHC krijgen.
Van de 15 geteste bestanddelen slechts vijf geselecteerd voor HCS-gebaseerde analyse en mocht berekenbare LD 50 (<20 mM) geregistreerd. Deze omvatten 1-aminonaphtalene, arseen (V), chroom (VI), Crotonaldehyde en fenol. Op basis van hun werking in de HCS kan 1-aminonaphtalene en fenol worden geïdentificeerd mitochondriale dysfunctie induceren, en samen met chroom (VI) als genotoxisch gebaseerd op de verhoogde histon H2AX fosforylering. Crotonaldehyde werd geïdentificeerd als oxidatieve stress inductor en Arseen als stress-kinase pathway activator.
Deze studie toont aan dat een combinatie van impedantie gebaseerde en HCS technologie verschaft een robuust hulpmiddel voor in vitro beoordeling van CS bestanddelen.
Introduction
Toxicologische risicobeoordeling is van oudsher vertrouwd op het gebruik van dierlijke modellen die, hoewel fundamenteel in de life sciences, zijn ook in verband met tekortkomingen, zoals inconsistent vertaalbaarheid voor de mens en de hoge kosten. Verder is er een toenemende poging om alternatieven voor dierproeven in de geest van "The 3Rs" 2 (vervanging, vermindering en verfijning) te vinden. Deze inspanningen werden versneld in de afgelopen jaren, niet alleen vanwege de recente ontwikkelingen zoals high-throughput technieken en systemen benaderingen, maar ook vanwege de wetgeving die het gebruik van dierproeven, vooral in de Europese Unie.
De complexiteit van cellulaire signaleringsroutes reguleren van de reactie op toxische beledigingen maakt het duidelijk dat het gebruik van één toxicologische eindpunten niet voldoende om de toxicologische hand van bepaalde verbindingen geven is. Hiervoor de wisselwerking tussen honderden interactie proteins bijdragen aan een biologisch netwerk moet ook rekening worden gehouden. Om het effect van toxische stoffen op deze netwerken bestuderen een systeem toxicologische benadering in combinatie met fenotypische midden- en hoge doorvoer screening assays nuttig potenties afleiden en tegelijkertijd zorgen voor meer informatie over het werkingsmechanisme van individuele toxische stoffen.
In deze studie hebben we gebruik HCS als krachtige screeningsmethode, dat bestaat uit een geautomatiseerde microscoop en een biologisch softwaretoepassing die kan verkrijgen, te verwerken en beeldgegevens afkomstig van specifieke fluorescentie gebaseerde cellulaire assays analyseren. Dit maakt visuele veranderingen binnen een cel te kwantificeren, op een enkele cel of subcellulair niveau, en vele parameters tegelijkertijd te analyseren. 3 werden bijvoorbeeld DNA double-strand breaks geëvalueerd onder toepassing van een antilichaam gebaseerde identificatie van histon H2AX fosforylatie en reactieve zuurstofspecies (ROS) werden gekwantificeerd onder toepassing van een cel-permduidelijker zichtbaar superoxide gevoelige kleurstof.
Omdat long epitheelcellen de eerste biologische barrière vormen tegen ingeademd toxische stoffen, zoals sigarettenrook, we benut primaire bronchiale epitheelcellen als een in vitro model om het effect van HPHCs gepubliceerd door de Amerikaanse Food and Drug Administration te profileren. 4 Dit handschrift is een vervolg -up op een eerdere studie 5 waarin we de biologische gevolgen van een andere deelverzameling van HPHCs geëvalueerd.
Als onderdeel van onze workflow te cytotoxiciteit in vitro te beoordelen, we in eerste instantie onderzocht de potenties van een selectie van 15 HPHC's, met behulp van een impedantie gebaseerde real-time mobiele analyse (RTCA) systeem dat liet ons toe om de dosis-bereik, geschikt voor de volgende HCS vast analyse (Figuur 1). Een HCS toxicologische evaluatie werd vervolgens uitgevoerd met behulp van negen meerdere parametrische eindpunten van cellulaire toxiciteit, elk is op twee tijdstippen (4 en 24 uur). De merkers die werden gebruikt waren indicatief voor mitochondriale toxiciteit, DNA schade, stress kinase, reactieve zuurstof species (ROS), glutathion (GSH) gehalte, caspase 3-7 activiteit, cytochroom C en afgifte celmembraan permeabiliteit, zoals beschreven in Tabel 1.
Onze aanpak ingeschakeld identificatie en karakterisering van het effect van sigarettenrook bestanddelen door de dosis en tijdsafhankelijke sampling. Uiteindelijk leverde dat een in vitro toxicologisch profiel voor elke HPHC. Multi-omics benaderingen kunnen ook worden gebruikt om de HCS analyse verder aanvullen. Dit zou uiteindelijk ook een dieper inzicht in de effecten op de cell signaling en / of transcriptie niveau.
Protocol
Representative Results
Discussion
De behoefte aan alternatieven voor dierproeven en voor nieuwe high throughput testen benaderingen zijn uitvoerig besproken in de afgelopen jaren. Dit heeft ertoe geleid dat wetenschappers en regelgevende instanties om alternatieve methoden voor standaard testen van de toxiciteit, met behulp van cellulaire assays die nauw nabootsen de fysiologie van doelweefsels te onderzoeken. In deze studie hebben we de toepassing van een combinatie van een real-time cell analyzer (RTCA) met een hoog gehalte screening (HCS) platform om de effecten van blootstelling aan één CS bestanddelen menselijke longepitheelcellen beoordelen aangetoond. Deze opstelling kan analoog worden toegepast op cytotoxiciteit geïnduceerd door diverse andere zwevende stoffen, zwevende deeltjes en nanodeeltjes evalueren. Bovendien kunnen de verkregen resultaten worden vergeleken met die van hele genoom transcriptomics en computationele werkwijzen op basis van causale biologische netwerken. Zoals eerder gemeld, deze aanpak konden we gegevens over de moleculaire route bevestigenverstoring bij CS blootstelling 5 met HCS eindpunten, het aanpakken van deze route verstoringen ook fenotype.
Als een flowchart assay, real-time cel analyse geeft cel-levensvatbaarheid-gerelateerde informatie op een dosis- en tijdsafhankelijke resolutie, die een betere besluitvorming welke dosis en blootstelling tijdstip gunstig voor downstream-analyse 14 kan zijn toelaat. Het principe van de analyse is gebaseerd op veranderingen in elektrische impedantie die door de cellen als ze hechten en verspreid over een kweekputje oppervlak bedekt met een gouden micro-elektrode. De impedantie wordt omgezet in een dimensieloze parameter genaamd cel-index, die kan worden gebruikt om celadhesie te controleren, verspreiding, morfologie en uiteindelijk cellevensvatbaarheid. Hoewel deze techniek geen informatie over cytotoxische mechanismen, de gevoeligheid maakt detectie van morfologische cellulaire veranderingen, zelfs bij zeer lage doses waarbij de HCS niet informatief (gegevens niet getoond). Gebaseerd op Previlende experimenten, hebben we vastgesteld dat RTCA methode kan morfologische veranderingen bij lagere doses dan de HCS eindpunten detecteren.
Na de eerste screening van de real-time cell analyzer, werd een HCS platform gebruikt om meer gedetailleerde informatie over de aard van cytotoxiciteit opgewekt door elke HPHC krijgen. De HCS assay panel mag HPHCs profileren ten opzichte van hun potentiële impact op cellulaire compartimenten / organellen, alsmede aan die welke genotoxiciteit of oxidatieve stress te identificeren. Hierbij bleek verschillende profielen waarbij de geselecteerde HPHCs induceren cytotoxiciteit NHBE cellen. In het algemeen zijn de verbindingen, behalve fenol, bleken necrose bij de hoogste geteste dosis. Consistent met een potentiële rol in tumorigenese 1-aminonaphtalene geïnduceerde fosforylering van H2AX als een marker voor genotoxiciteit, maar de HCS paneel ook onbedekt activiteit van dit HPHC in de mitochondriale toxiciteit uitlezing (massa toe en cytochroom C release) en oxidatieve stress (GSH uitputting). Evenzo, zoals hiervoor beschreven, fenol werd geïdentificeerd als mitochondriale disfunctie veroorzaken en leiden tot DNA-schade en GSH uitputting. Chroom (VI), één van de verbindingen ingedeeld in groep I carcinogenen en Crotonaldehyde werden geïdentificeerd als zowel genotoxisch, met name chroom (VI) ook geïnduceerde apoptose (caspase cascade activering) en Crotonaldehyde veroorzaakt verhoogde ROS generatie. Tenslotte Arseen (V), bleek fosforylering cJun dat een merker van stress kinase pathway activatie induceren.
In deze studie hebben we gebruik gemaakt NHBE cellen als model voor long epitheelcellen in vitro. Met behulp van deze cellen in een HCS omgeving is ongekend en stelde het onderzoek van een breder scala van eindpunten, waaronder genotoxiciteit en oxidatieve stress markers. Zowel levende cellen en vaste cel kleuring methoden beschreven in onze protocollen demonstreren de flexibiliteit van de algehele techniek. in fact, kan precies dezelfde protocollen worden toegepast op een breder scala van doelstellingen die door het gebruik van een fluorescente kleurstof of antilichaam kan worden gericht. Voor het succesvol uitvoeren van de levende kleuringsprotocollen, is het belangrijk om de incubatietijd te respecteren, zoals sommige van de kleurstoffen hebben een beperkte halfwaardetijd en het fluorescentiesignaal afnemen vóór de beeldverwerving is voltooid. Het is ook belangrijk om te overwegen dat als een ander celtype wordt gebruikt, alle omstandigheden de kleuring opnieuw moet worden geëvalueerd, de optimale kleurstof concentratie en de incubatietijd kan verschillen.
In de huidige papieren hebben we een scenario waarin slechts vijf verbindingen waarbij gescreend met de HCS methodologie beschreven. Gezien de hiervoor beschreven plaatindeling, werden ze gedoseerd via 2 verschillende sets plaat voor een totaal van 24 platen (6 assays en 2 tijdstippen) .Het aantal platen kan ook worden verhoogd, waardoor het gelijktijdig screenen van verbindingen of meer de invesderzoek van meer eindpunten. Alvorens dit te doen, echter, moet men rekening mee houden dat bepaalde eindpunten (GSH en ROS) vereisen onmiddellijke overname, en als gevolg daarvan, moet de dosering van de platen worden uitgevoerd in een gespreide manier aan de overname van de vorige plaat mogelijk te maken. Anderzijds, met een vaste cel kleuring protocol vormt een voordeel als de platen kunnen worden gestapeld, onderbreken protocol naar elke stap na de fixatie, voor de voltooiing van de kleuring procedure later. Deze aanpak, bijvoorbeeld, zou de operator te voorzien van de tijd om alle levende cel kleuring platen te voltooien, zonder afbreuk te doen aan de kwaliteit van de gegevens.
De workflow verder te optimaliseren door het verminderen van het aantal platen, zou het ook mogelijk zijn om meer eindpunten samen multiplexen. Bijvoorbeeld in deze context DNA Schade en Stress Kinase samen konden worden onderzocht eenvoudig met behulp van twee secundaire antilichaam met fluorochromen emitterende in verschillende channels. Continue ontwikkeling van de HCS-platform, waaronder volledig geautomatiseerde cel enten verbinding verdunning dosering en kleuring, evenals de toevoeging van nieuwe eindpunten zullen het vermogen van de HCS platform verder uitbreiden als een krachtig profiling instrument HPHCs op epitheel- en andere celtypen .
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag karsta Luettich en Grégory Vuillaume bedanken voor hun herziening van het manuscript.
Materials
| Cellomics ArrayScan VTI HCS Reader | Thermo | N01-0002B | |
| xCelligence RTCA MP | ACEA | 05331625001 | |
| Screener (HCS) | Genedata | NA | |
| CASY counter TTC | Roche | 05 651 719 001 | |
| e-Plates VIEW 96 | ACEA | 06 472 451 001 | |
| RTCA Frame 96 | ACEA | 05232392001 | |
| RTCA Cardio Temperature Tool | ACEA | 2801171 | |
| Plate sealer breathseal | Greiner bio-one | 676051 | |
| Normal Human Bronchial Epithelial cells (NHBE) | Lonza | CC-2540 | non-smoking 60-year-old Caucasian male donor |
| BEGM BulletKit | Lonza | CC-3170 | Warm at 37 °C before use |
| ReagentPack Subculture Reagents kit | Lonza | CC-5034 | Warm at 37 °C before use |
| Penicillin/Streptomycin (100x) | Corning | 30-002-CI | |
| Easy Flask filter cap 75cm2 | Thermo Scientific | 12-565-349 | |
| 96 well assay plate black | Corning | 3603 | |
| Hoechst 33342 | Fisher Scientific | PI-62249 | |
| Draq5 (For Far Red Nuclear Staining) | Biostatus | DR50200 | |
| Mitochondrial Dye: MitoTracker Red CMXRos | Life technologies | M-7512 | |
| Mitochondrial Dye: MitoTracker Red CM-H2XRos | Life technologies | M-7513 | |
| ROS Dye: Dihydroethidium | Sigma | D7008 | |
| ROS Dye: CellROX | Life technologies | C10422 | |
| ROS Dye: MitoSOX | Life technologies | M36008 | |
| GSH Dye: Monochlorobimane | Sigma | 69899 | Toxic |
| GSH Dye: Monobromobimane | Life technologies | M-1378 | Toxic |
| Membrane permeability Dye: YO-PRO-1 | Life technologies | Y3603 | Irritating |
| Membrane permeability Dye: TO-PRO-1 | Life technologies | T3602 | Irritating |
| Membrane permeability Dye: TOTO-1 | Life technologies | T3600 | Irritating |
| Caspase Dye: Cellevent Caspase 3/7 green | Life technologies | C10423 | Irritating |
| Anti-Cytochrome C antibody (Mouse) | Thermo | MA5-11823 | |
| Anti-phospho-c-Jun antibody (Mouse) | Thermo | MA5-15889 | |
| Anti-phospho-H2AX antibody (Mouse) | Thermo | MA1-2022 | |
| Goat anti-Mouse IgG DyLight 650 | Abcam | ab96878 | |
| 10X permeabilization buffer | Fisher | 8408400 | |
| 4% Formaldehyde solution | Sigma | F1635 | Toxic |
| 10X blocking buffer | Fisher | 8408500 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
| Hanks' Balanced Salt solution | Sigma | H8264 | |
| Staurosporine | Sigma | S4400 | Toxic |
| Valinomycin | Sigma | V0627 | Toxic |
| Paraquat | Sigma | 36541 | Toxic |
| Anisomycin | Sigma | A9789 | Toxic |
| Ethacrynic acid | Sigma | E4754 | Toxic |
| 1-Aminonaphthalene | Sigma | 34390 | Toxic |
| 2-Nitropropane | Sigma | 130265 | Toxic |
| Acetamide | Sigma | 695122 | Toxic |
| Acetone | Sigma | 650501 | Toxic |
| Acrylamide | Sigma | A9099 | Toxic |
| Arsenic (V) | Sigma | A6756 | Toxic |
| Benzene | Sigma | 12540 | Toxic |
| Chromium (VI) | Sigma | 216623 | Toxic |
| Crotonaldehyde | Sigma | 262668 | Toxic |
| Methyl ethyl ketone | Sigma | 34861 | Toxic |
| Nickel | Sigma | 203866 | Toxic |
| Nitrobenzene | Sigma | 48547 | Toxic |
| Phenol | Sigma | P5566 | Toxic |
| Quinoline | Sigma | 241571 | Toxic |
| Toluene | Sigma | 34866 | Toxic |
References
- Rodgman, A., Perfetti, T. A. . The chemical components of tobacco and tobacco smoke. , (2013).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. . The Principles of Humane Experimental Technique. , (1959).
- Zock, J. M. Applications of high content screening in life science research combinatorial chemistry & high throughput screening. Comb. Chem. High. Throughput. Screen. 132 (9), 870-876 (2009).
- US Food and Drug Administration. . Harmful and potentially harmful constituents in tobacco products and tobacco smoke; established list, federal register. , 20034-20037 (2012).
- Gonzalez-Suarez, I. Systems Biology Approach for Evaluating the Biological Impact of Environmental Toxicants in Vitro. Chem. Res. Toxicol. 27 (3), 367-376 (2014).
- Camilleri-Broet, S., Vanderwerff, H., Caldwell, E., Hockenbery, D. Distinct alterations in mitochondrial mass and function characterize different models of apoptosis. Exp. Cell. Res. 239 (2), 277-292 (1998).
- Li, P., et al. Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates and apoptotic protease cascade. Cell. 91 (4), 479-489 (1997).
- Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. Double strand breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J. Biol. Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).
- Westwick, J. K., Weitzel, C., Minden, A., Karin, M., Brenner, D. A. Tumor necrosis factor α stimulates AP-1 activity through prolonged activation of the c-jun kinase. J. Biol. Chem. 269 (42), 26396-26401 (1994).
- Bindokas, V. P., Jordán, J., Lee, C. C., Miller, R. J. Superoxide production in rat hippocampal neurons: selective imaging with hydroethidine. J. Neurosci. 16 (4), 1324-1336 (1996).
- Barhoumi, R., Bailey, R. H., Burghardt, R. C. Kinetic analysis of glutathione in anchored cells with monochlorobimane. J. Cytometry. 19 (3), 226-234 (1994).
- Huang, T. C., Lee, J. F., Chen, J. Y. Pardaxin an antimicrobial peptide, triggers caspase-dependent and ROS-mediated apoptosis in HT-1080 Cells. Mar. Drugs. 9 (10), 1995-2009 (2011).
- Bao, S., Knoell, D. L. Zinc modulates cytokine-induced lung epithelial cell barrier permeability. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 291 (6), L1132-L1141 (2006).
- Xia, M., et al. Compound Cytotoxicity Profiling Using Quantitative High-Throughput Screening. Environ Health Perspect. 116 (3), 284-291 (2008).
