عالية تحليل فحص المحتوى لتقييم الآثار السمية للمكونات الضارة والمؤذية يحتمل (HPHC)
Summary
The objective of the study was to assess the biological impact of 15 cigarette smoke constituents using a combination of an impedance-based real time cell analyzer and a high-content screening (HCS)-based platform for toxicological assessment in vitro. This study provides information on effective doses, toxicity and modes of action of the tested compounds.
Abstract
دخان السجائر (CS) هو عامل خطر رئيسي لأمراض القلب والأوعية الدموية والرئة. لأن CS هو الهباء الجوي المعقدة التي تحتوي على أكثر من 7000 مادة كيميائية (1)، يمثل تحديا لتقييم مساهمات المكونات الفردية لسميتها العامة. ملامح السمية من المكونات الفردية وكذلك خليط يمكن مع ذلك وضع في المختبر، من خلال تطبيق أعلى مستوى من خلال-وضع أدوات الفحص، التي تمكن التنميط المكونات الضارة والمؤذية يحتمل (HPHCs) من دخان التبغ، على النحو المحدد من قبل إدارة الغذاء والدواء الأمريكية إدارة (FDA) 2
لتقييم أولي، تم استخدام أداة القائم على مقاومة لفي الوقت الحقيقي، وتقييم التسمية خالية من السمية في المجمع. تعتمد قراءات صك بشأن التصاق الخلية، الجدوى والتشكل التي توفر جميع معا لمحة عامة عن الوضع الخلية. معلمة أبعاد، واسمه مؤشر الخلية، ويستخدم لتقدير. وهناك مجموعة من DIFوقد وضعت ferent بروتوكولات تلطيخ لتحقيق مقرها التصوير مضان وكانت تستخدم منصة HCS للحصول على معلومات أكثر تعمقا على نوع من السمية الخلوية التي تسببها كل HPHC.
من 15 مكونات اختبار، وقد تم اختيار خمسة فقط من أجل التحليل القائم HCS-كما سجلت LD محسوب 50 (<20 مم). وشملت هذه 1-aminonaphtalene، الزرنيخ (V) والكروم (VI)، Crotonaldehyde والفينول. وبناء على تأثيرها في HCS، يمكن تحديد 1-aminonaphtalene والفينول للحث على ضعف الميتوكوندريا، و، جنبا إلى جنب مع الكروم (VI) كما السمية الوراثية على أساس زيادة الفسفرة هيستون H2AX. وقد تم تحديد Crotonaldehyde بمثابة محفز الاكسدة والزرنيخ كما إجهاد كيناز مسار المنشط.
وتوضح هذه الدراسة أن مجموعة من التكنولوجيات القائمة على مقاومة وHCS يوفر أداة قوية لتقييم في المختبر من مكونات CS.
Introduction
وقد اعتمد تقييم المخاطر السمية تاريخيا على استخدام النماذج الحيوانية التي، على الرغم أساسية في علوم الحياة، وترتبط أيضا مع أوجه القصور مثل ترجمتها غير متناسقة للبشر والتكلفة العالية. وعلاوة على ذلك، كانت هناك جهود متزايدة لإيجاد بدائل للتجارب على الحيوانات في روح "و3RS" 2 (استبدال، والحد، وصقل). وقد تسارعت هذه الجهود على مدى السنوات القليلة الماضية، ليس فقط بسبب التطورات الحديثة مثل تقنيات عالية الإنتاجية ونهج النظم البيولوجية، ولكن أيضا بسبب التشريعات التي تقيد استخدام التجارب على الحيوانات، وخاصة في الاتحاد الأوروبي.
تعقيد مسارات الإشارات الخلوية التي تنظم ردا على الشتائم السامة يجعل من الواضح أن استخدام نهايات سمية واحدة لن تكون كافية لوصف أساس سمية بعض المركبات. لهذا، فإن التفاعل بين مئات من التفاعل صسوف roteins المساهمة في شبكة البيولوجية أيضا بحاجة إلى أن تؤخذ بعين الاعتبار. لدراسة تأثير المواد السامة على تلك الشبكات، نهج النظام السموم جنبا إلى جنب مع المتوسط المظهرية وعالية الإنتاجية فحوصات الكشف مفيد للاستدلال الفعليات، وفي الوقت نفسه توفير مزيد من المعلومات حول آلية عمل المواد السامة الفردية.
في هذه الدراسة، قمنا بتوظيف HCS كأداة فحص قوية، والتي تتألف من المجهر الآلي وتطبيق البرمجيات البيولوجي، التي يمكن اكتساب ومعالجة وتحليل البيانات صورة المستمدة من المقايسات الخلوية محددة على أساس مضان. وهذا يسمح لالتغيرات البصرية داخل الخلية ليكون كميا، في خلية واحدة أو على مستوى التحت خلوية، والعديد من المعلمات ليتم تحليلها في وقت واحد. 3 على سبيل المثال، تم تقييم الحمض النووي فواصل مزدوج الجديلة باستخدام الهوية القائمة على الضد من الفسفرة هيستون H2AX و وتم قياس كمية أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS) باستخدام خلية بيرمالفائق eable صبغة حساسة.
لأن الرئة الخلايا الظهارية تمثل عائقا البيولوجي الأول ضد المواد السامة عن طريق الاستنشاق، بما في ذلك دخان السجائر، ونحن استخدام الخلايا الظهارية الشعب الهوائية الأولية باعتبارها نموذجا في المختبر لمحة عن تأثير HPHCs نشرت من قبل إدارة الغذاء والدواء في الولايات المتحدة. 4 هذه المخطوطة هي متابعة -up على دراسة سابقة 5 التي قمنا بتقييم الأثر البيولوجي من مجموعة فرعية مختلفة من HPHCs.
كجزء من سير العمل لدينا لتقييم سمية الخلايا في المختبر، قمنا بتقييم البداية الفعليات من مجموعة مختارة من 15 في HPHC، وذلك باستخدام الوقت الحقيقي التحليل الخلوي على أساس مقاومة (RTCA) النظام الذي يسمح لنا لإقامة جرعة نطاقات، ومناسبة لHCS لاحق تحليل (الشكل 1). تقييم HCS السمية وبعد ذلك أجريت باستخدام تسع نقاط النهاية متعددة حدودي السمية الخلوية، ومراقبة كل في نقطتين الساعة (4 و 24 ساعة). كانت علامات المستخدمة تدل على سمية الميتوكوندريا، الحمض النووي من التلف، كيناز الإجهاد، وأنواع الاكسجين التفاعلية (ROS)، الجلوتاثيون المحتوى (GSH)، كاسباس 3-7 النشاط، السيتوكروم الإفراج C ونفاذية غشاء الخلية، كما هو موضح في الجدول رقم 1.
نهجنا تمكين تحديد وتوصيف تأثير مكونات دخان السجائر من خلال أخذ العينات dose- وتعتمد على الوقت. في نهاية المطاف، وهذا ينتج في المختبر السمي لكل HPHC. ويمكن أيضا نهج متعدد OMICS استخدامها لزيادة تكمل التحليل HCS. وهذا من شأنه في نهاية المطاف أيضا توفير فهم أعمق للآثار في الخلايا مما يشير الى و/ أو مستوى النسخي.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد نوقشت احتياجات بدائل التجارب على الحيوانات وأساليب جديدة عالية الإنتاجية اختبار على نطاق واسع خلال السنوات الماضية. وقد أدى ذلك العلماء والسلطات التنظيمية للتحقيق في طرق بديلة لاختبار السمية القياسي، وذلك باستخدام المقايسات الخلوية التي تحاكي بشكل وثيق في علم وظائف الأعضاء من الأنسجة المستهدفة. في هذه الدراسة، لقد أثبتنا مدى انطباق الجمع بين خلية محلل في الوقت الحقيقي (RTCA) مع منصة فحص المحتوى العالي (HCS) لتقييم تأثير التعرض للهيئات المكونة CS واحدة على الخلايا الظهارية رئة الإنسان. هذا الإعداد يمكن تطبيقها بالقياس لتقييم السمية الخلوية الناجمة عن مختلف الملوثات الأخرى المحمولة جوا، والجسيمات المحمولة جوا، والجسيمات النانوية. وعلاوة على ذلك، فإن النتائج التي تم الحصول عليها يمكن أن تتطابق مع تلك من transcriptomics كامل الجينوم والطرق الحسابية القائمة على شبكات البيولوجية السببية. كما ذكرت سابقا، فإن هذا النهج سمح لنا لإثبات البيانات على المسار الجزيئياضطراب عند التعرض CS 5 مع نهايات HCS، ومعالجة هذه الاضطرابات الطريق أيضا ظاهريا.
كما فحص مخطط، ويوفر تحليل الخلية في الوقت الحقيقي خلية المعلومات المتعلقة الجدوى في قرار dose- وتعتمد على الوقت، والذي يسمح تحسين عملية صنع القرار التي جرعة ونقطة زمنية التعرض قد تكون مواتية لتحليل المصب 14. مبدأ محلل يعتمد على التغيرات في مقاومة الكهربائية المولدة من الخلايا مثلما نعلق وانتشار على سطح الثقافة جيدا مغطاة مسرى مكروي الذهب. يتم تحويل مقاومة في معلمة أبعاد اسمه خلية المؤشر، والتي يمكن استخدامها لمراقبة التصاق الخلية، ونشر، مورفولوجيا وفي نهاية المطاف الخلية قدرتها على البقاء. على الرغم من هذه التقنية لا توفر معلومات عن آليات السامة للخلايا، حساسيتها تمكن من الكشف عن التغيرات الخلوية المورفولوجية حتى في الجرعات المنخفضة جدا التي وHCS ليس بالمعلومات (لا تظهر البيانات). وبناء على PREVIتجارب الأوس، وقد لاحظنا أن منهجية RTCA غير قادرة على كشف التغيرات الشكلية في الجرعات المنخفضة مقارنة النهاية HCS.
وبعد الفحص الأولي مع الخلية محلل في الوقت الحقيقي، وكان يستخدم منصة HCS للحصول على معلومات أكثر تعمقا على نوع من السمية الخلوية التي تسببها كل HPHC. وHCS لوحة فحص سمح لمحة HPHCs نحو آثارها المحتملة على الأجزاء الخلوية / العضيات وكذلك لتحديد تلك التي تستقطب السمية الوراثية أو الأكسدة الإجهاد. وكشف تحليل الشخصية المتميزة بموجبه HPHCs اختيار لحث على السمية الخلوية في الخلايا NHBE. بشكل عام، فإن جميع المركبات، باستثناء الفينول وجدت، للحث على نخر في جرعات أعلى اختبارها. وانسجاما مع دور محتمل في تطور مرض السرطان 1-aminonaphtalene الفسفرة الناجم من H2AX كعلامة على السمية الجينية، ولكن لوحة HCS أيضا النشاط المكشوف من هذا HPHC في قراءات سمية الميتوكوندريا (زادت كتلة والسيتوكروم C releaحد ذاتها) والاكسدة (GSH نضوب). وبالمثل، كما هو موضح سابقا، تم تحديد الفينول للحث على ضعف الميتوكوندريا، وتسبب التلف في الحمض النووي، فضلا عن استنزاف الجلوتاثيون. الكروم (VI)، واحدة من مركبات تصنف أنا المسرطنة المجموعة، وCrotonaldehyde تم أيضا تحديد كل السمية كما، ولا سيما الكروم (VI) الخلايا التي يسببها أيضا (تفعيل تتالي كاسباس) وCrotonaldehyde تسبب زيادة توليد ROS. أخيرا الزرنيخ (الخامس)، وجدت للحث على cJun الفسفرة الذي هو علامة من تفعيل مسار الضغط كيناز.
في هذه الدراسة، ونحن استخدام الخلايا NHBE كنموذج للخلايا الظهارية الرئة في المختبر. باستخدام هذه الخلايا في إعداد HCS لم يسبق له مثيل، ومكن التحقيق من مجموعة واسعة من النهاية، بما في ذلك السمية الوراثية والاكسدة علامات. وقد وصفت كل من الخلية الحية والنهج خلية تلطيخ ثابتة ضمن بروتوكولات لدينا، مما يدل على مرونة تقنية الشاملة. في والفعل، يمكن تطبيق نفس البروتوكولات لمجموعة واسعة من الأهداف، والتي يمكن أن تعالج عن طريق استخدام أي صبغة الفلورسنت أو الأجسام المضادة. لتنفيذ الناجح لبروتوكولات تلطيخ الحية، فإنه من المهم احترام فترة حضانة، وبعض الأصباغ لديها محدودة نصف العمر وإشارة مضان قد يقلل من قبل الانتهاء من الحصول على الصور. ومن المهم أيضا أن تنظر أنه إذا تم استخدام نوع من الخلايا المختلفة، وجميع الشروط تلطيخ ينبغي إعادة تقييمها، وتركيز الصبغة الأمثل وفترة حضانة قد تكون مختلفة.
في هذه الورقة التي وصفناها سيناريو حيث مركبات خمس فقط حيث فحص مع منهجية HCS. النظر في تخطيط لوحة الموصوفة سابقا، كانوا مداوي أكثر من 2 مجموعات لوحة مختلفة عن ما مجموعه 24 لوحات (6 المقايسات و 2 نقاط الوقت) ويمكن أيضا أن تزيد. وعدد من لوحات، وبالتالي السماح للفحص في وقت واحد من أكثر المركبات أو والتحرياتtigation المزيد من النهاية. قبل القيام بذلك، ومع ذلك، ينبغي للمرء أن تأخذ في الاعتبار أن بعض النقاط الطرفية (GSH وROS) يتطلب اكتساب فوري، ونتيجة لذلك، يجب أن يتم تنفيذ الجرعات من لوحات بطريقة متداخلة للسماح اقتناء لوحة السابقة. من ناحية أخرى، وذلك باستخدام ثابت بروتوكول الخلية تلطيخ يمثل ميزة كما يمكن أن تكون مكدسة لوحات، ووقف على البروتوكول في أي خطوة بعد التثبيت، لاستكمال إجراءات تلطيخ في مرحلة لاحقة. هذا النهج، على سبيل المثال، من شأنه أن يوفر المشغل مع الوقت لاستكمال جميع ألواح الخلايا تلطيخ الحية دون المساس بنوعية البيانات.
لمزيد من تحسين سير العمل من خلال خفض عدد من لوحات، وسيكون أيضا من الممكن أن تعدد نقاط نهاية معا. على سبيل المثال في هذا السياق ضرر الحمض النووي والإجهاد كيناز يمكن أن يتم التحقيق معا ببساطة باستخدام اثنين من الأجسام المضادة الثانوية مع fluorochromes تنبعث منها في ج مختلفةhannels. والتطوير المستمر للمنصة HCS، بما في ذلك البذر مؤتمتة بالكامل الخلية، وتخفيف مركب، الجرعات وتلطيخ، فضلا عن إضافة النهاية الجديدة على توسيع قدرات منصة HCS كأداة التنميط قوية لHPHCs على الظهارية وأنواع الخلايا الأخرى .
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر Karsta Luettich وغريغوري Vuillaume لاستعراضها من المخطوطة.
Materials
| Cellomics ArrayScan VTI HCS Reader | Thermo | N01-0002B | |
| xCelligence RTCA MP | ACEA | 05331625001 | |
| Screener (HCS) | Genedata | NA | |
| CASY counter TTC | Roche | 05 651 719 001 | |
| e-Plates VIEW 96 | ACEA | 06 472 451 001 | |
| RTCA Frame 96 | ACEA | 05232392001 | |
| RTCA Cardio Temperature Tool | ACEA | 2801171 | |
| Plate sealer breathseal | Greiner bio-one | 676051 | |
| Normal Human Bronchial Epithelial cells (NHBE) | Lonza | CC-2540 | non-smoking 60-year-old Caucasian male donor |
| BEGM BulletKit | Lonza | CC-3170 | Warm at 37 °C before use |
| ReagentPack Subculture Reagents kit | Lonza | CC-5034 | Warm at 37 °C before use |
| Penicillin/Streptomycin (100x) | Corning | 30-002-CI | |
| Easy Flask filter cap 75cm2 | Thermo Scientific | 12-565-349 | |
| 96 well assay plate black | Corning | 3603 | |
| Hoechst 33342 | Fisher Scientific | PI-62249 | |
| Draq5 (For Far Red Nuclear Staining) | Biostatus | DR50200 | |
| Mitochondrial Dye: MitoTracker Red CMXRos | Life technologies | M-7512 | |
| Mitochondrial Dye: MitoTracker Red CM-H2XRos | Life technologies | M-7513 | |
| ROS Dye: Dihydroethidium | Sigma | D7008 | |
| ROS Dye: CellROX | Life technologies | C10422 | |
| ROS Dye: MitoSOX | Life technologies | M36008 | |
| GSH Dye: Monochlorobimane | Sigma | 69899 | Toxic |
| GSH Dye: Monobromobimane | Life technologies | M-1378 | Toxic |
| Membrane permeability Dye: YO-PRO-1 | Life technologies | Y3603 | Irritating |
| Membrane permeability Dye: TO-PRO-1 | Life technologies | T3602 | Irritating |
| Membrane permeability Dye: TOTO-1 | Life technologies | T3600 | Irritating |
| Caspase Dye: Cellevent Caspase 3/7 green | Life technologies | C10423 | Irritating |
| Anti-Cytochrome C antibody (Mouse) | Thermo | MA5-11823 | |
| Anti-phospho-c-Jun antibody (Mouse) | Thermo | MA5-15889 | |
| Anti-phospho-H2AX antibody (Mouse) | Thermo | MA1-2022 | |
| Goat anti-Mouse IgG DyLight 650 | Abcam | ab96878 | |
| 10X permeabilization buffer | Fisher | 8408400 | |
| 4% Formaldehyde solution | Sigma | F1635 | Toxic |
| 10X blocking buffer | Fisher | 8408500 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
| Hanks' Balanced Salt solution | Sigma | H8264 | |
| Staurosporine | Sigma | S4400 | Toxic |
| Valinomycin | Sigma | V0627 | Toxic |
| Paraquat | Sigma | 36541 | Toxic |
| Anisomycin | Sigma | A9789 | Toxic |
| Ethacrynic acid | Sigma | E4754 | Toxic |
| 1-Aminonaphthalene | Sigma | 34390 | Toxic |
| 2-Nitropropane | Sigma | 130265 | Toxic |
| Acetamide | Sigma | 695122 | Toxic |
| Acetone | Sigma | 650501 | Toxic |
| Acrylamide | Sigma | A9099 | Toxic |
| Arsenic (V) | Sigma | A6756 | Toxic |
| Benzene | Sigma | 12540 | Toxic |
| Chromium (VI) | Sigma | 216623 | Toxic |
| Crotonaldehyde | Sigma | 262668 | Toxic |
| Methyl ethyl ketone | Sigma | 34861 | Toxic |
| Nickel | Sigma | 203866 | Toxic |
| Nitrobenzene | Sigma | 48547 | Toxic |
| Phenol | Sigma | P5566 | Toxic |
| Quinoline | Sigma | 241571 | Toxic |
| Toluene | Sigma | 34866 | Toxic |
References
- Rodgman, A., Perfetti, T. A. . The chemical components of tobacco and tobacco smoke. , (2013).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. . The Principles of Humane Experimental Technique. , (1959).
- Zock, J. M. Applications of high content screening in life science research combinatorial chemistry & high throughput screening. Comb. Chem. High. Throughput. Screen. 132 (9), 870-876 (2009).
- US Food and Drug Administration. . Harmful and potentially harmful constituents in tobacco products and tobacco smoke; established list, federal register. , 20034-20037 (2012).
- Gonzalez-Suarez, I. Systems Biology Approach for Evaluating the Biological Impact of Environmental Toxicants in Vitro. Chem. Res. Toxicol. 27 (3), 367-376 (2014).
- Camilleri-Broet, S., Vanderwerff, H., Caldwell, E., Hockenbery, D. Distinct alterations in mitochondrial mass and function characterize different models of apoptosis. Exp. Cell. Res. 239 (2), 277-292 (1998).
- Li, P., et al. Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates and apoptotic protease cascade. Cell. 91 (4), 479-489 (1997).
- Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. Double strand breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J. Biol. Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).
- Westwick, J. K., Weitzel, C., Minden, A., Karin, M., Brenner, D. A. Tumor necrosis factor α stimulates AP-1 activity through prolonged activation of the c-jun kinase. J. Biol. Chem. 269 (42), 26396-26401 (1994).
- Bindokas, V. P., Jordán, J., Lee, C. C., Miller, R. J. Superoxide production in rat hippocampal neurons: selective imaging with hydroethidine. J. Neurosci. 16 (4), 1324-1336 (1996).
- Barhoumi, R., Bailey, R. H., Burghardt, R. C. Kinetic analysis of glutathione in anchored cells with monochlorobimane. J. Cytometry. 19 (3), 226-234 (1994).
- Huang, T. C., Lee, J. F., Chen, J. Y. Pardaxin an antimicrobial peptide, triggers caspase-dependent and ROS-mediated apoptosis in HT-1080 Cells. Mar. Drugs. 9 (10), 1995-2009 (2011).
- Bao, S., Knoell, D. L. Zinc modulates cytokine-induced lung epithelial cell barrier permeability. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 291 (6), L1132-L1141 (2006).
- Xia, M., et al. Compound Cytotoxicity Profiling Using Quantitative High-Throughput Screening. Environ Health Perspect. 116 (3), 284-291 (2008).
