JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Çeşitli Dokularda Bağışıklık Hücreleri Hastalık bağımlı Dağıtım Fareler ve Değerlendirilmesi Deneysel Otoimmün Ensefalomyelitli indüksiyon

Published: May 08, 2016
doi:
10.3791/53933
, , , , , ,
1Institute of Clinical Pharmacology,Goethe University Hospital Frankfurt, 2Project Group for Translational Medicine & Pharmacology,Fraunhofer IME

Summary

This manuscript describes the methods for induction and scoring of the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model, together with the assessment of immune cell distribution and mRNA cytokine levels in lymph nodes, spleen, blood and spinal cord using flow cytometry and quantitative PCR, respectively, at various disease phases.

Abstract

Multipl skleroz, bilişsel, motor bozukluğu ile sonuçlanan santral sinir sistemi (CNS) lezyon formasyonu ile karakterize bir enflamatuar otoimmün hastalık, olduğu tahmin edilmektedir. Ayrıca, CNS'de lezyon oluşması, motor hasar ile karakterizedir ve otoimmün ve enflamatuar reaksiyonların etkili olduğu için, deneysel otoimmün ensafalomiyelitis (EAE), MS için yararlı bir hayvan modelidir. EAE modelleri bir miyelin oligodendrosit proteini farede (MOG) 35-55 türetilmiş bir peptit ile indüklenir. EAE fareler ilerleyici bir hastalık seyrini gelişir. Bu ders, üç aşamaya ayrılır: preklinik faz (gün 0-9), hastalık başlangıcı (gün 10 – 11) ve akut faz (gün 12 – 14). MS ve 'EAE CNS infiltre otoreaktif T-hücreleri tarafından indüklenir. Bu T hücreleri, daha bağışıklık hücrelerinin işe neden kemokinler ve sitokinler salgılarlar. Omurilik d nedenle, immün hücre dağılımıÜç hastalık evrelerini uring araştırılmıştır. T hücreleri, B hücreleri ve monositler aktivasyonu / çoğalması / toplama başladığı hastalığın zaman noktası vurgulamak için, lenf düğümleri, dalak ve kan immün hücre dağılımı da değerlendirildi. Ayrıca, üç hastalık aşamalarında çeşitli sitokinlerin (IL-1β, IL-6, IL-23, TNFa, IFNy) seviyeleri, hastalığın enflamatuar süreçleri hakkında bilgi edinmek için, tespit edilmiştir. Sonuç olarak, veri EAE patoloji sırasında bağışıklık hücrelerinin fonksiyonel profilinin bir bakış sağlar.

Introduction

Multipl skleroz (MS) ve karşılık gelen bir hayvan modeli, deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE), merkezi sinir sisteminde (CNS) otoimmün nöroenflamasyon değişiklikleri göstermektedir. Erken aktif MS ve 'EAE lezyonlar infiltre bağışıklık hücrelerinin varlığı ile karakterize edilir. Etiolojisi bilinmemektedir, ancak yaygın reaktif T hücrelerinin aracılık ettiği miyelin yıkımına dahil kabul edilir. Bu oto-reaktif T-hücreleri, dolaşım B hücreleri, monositler ve nötrofiller gibi diğer bağışıklık hücreleri çekmek pro-enflamatuar sitokinler ve kemokinleri salgılar. Monositler makrofajlar içine ayırt. reaktif T hücresi tarafından salgılanan interferon gamma (IFNy) pro-enflamatuar makrofajlar içine makrofajları polarizes. oligodendrositlere apoptozu teşvik pro-inflamatuar makrofajlar bırakma sitokinler ve reaktif oksijen türleri. oligodendrosit ölüm demiyelinizasyon yol açar. Bundan başka, B hücreleri, p ayırtsonuçta miyelin bozulması ile sonuçlanan lasma hücreleri ve miyelin kılıf karşı bırakma otoantikorlar. Miyelin kaybı akson ve nöronların bozulması ve böylece MS 1 temel özelliklerini temsil CNS'de lezyon sitelerinin oluşumuna yol açar. Çevresinde, T hücreleri ve B hücreleri, lenf nodüllerinde aktive edilir, bu dalakta çoğalır ve merkezi sinir sistemi içine dolaşım içinden yer değiştirmektedir. Monosit ve nötrofillerin kemik iliğinde çoğalır ve merkezi sinir sistemi içine dolaşımla göç de.

kana veya MSS içine kan kemik iliği, dalak ve lenf düğümleri lökosit ekstravazasyon kemokin ve kemokin reseptörlerinin aracılık ettiği lökositler ve endotel arasındaki moleküler etkileşimler de dahil olmak üzere birçok faktöre bağlıdır çok aşamalı bir süreçtir. çeşitli hücre tipleri tarafından kemokinlerin üretimini bağışıklık reaksiyonunun ne indüklenebilirDaha sonra enflamasyon 2,3 siteye bağışıklık hücrelerini toplayan, tümör nekroz faktörü-a (TNFa), IFNy ve interlökin-6 (IL-6) gibi sitokinlerle n. Bağışıklık hücreleri enflamatuar sitesine hücre tipine ve taşıma yolunun bağlı olarak, kendi yüzeyi üzerinde kemokin reseptörlerinin bir alt sunulmaktadır. Bu nedenle, CXCR2, CCR1 ve CXCR1, kemik iliği ve kanda 4 olgun nötrofiller üzerinde tanımlı ve onun ligandlan, CXCL2, CCL5 ya CXCL6 bağlanması sırasıyla, nötrofil aktive eder ve daha sonra hücre göçü endotele yapışıklıklarını teşvik eder ve dokulara 5-9 içine. CCL2 ve CCL20 sırasıyla CCR2 11 ve CCR6 12 ifade monositler ve Th1 / Th17 hücreleri 10, çekmek. T hücreleri, monositler ve makrofajlar dahil olmak üzere, 13 farklı hücre tipleri tarafından eksprese CCR1 ve CCR5, CCI3, CCL5 ve CCL7 bağlanan ve MS 14 sırasında yukarı düzenlenen edilir. CXCR3 T hücreleri üzerinde ifade edilir ve CCL9, CCL10 bağlanır veCCL11 15.

MS tedavisinde bir ana strateji bağışıklık hücrelerinin azalması veya merkezi sinir sistemi içine bağışıklık hücre infiltrasyonu önlenmesidir. Bu nedenle, belirli bir kemokin reseptörlerinin blokajı EAE de araştırılmıştır. Antagonizma veya CCR1 16, CCR2 17 genetik silme, CCR7 18 veya CXCR2 19 düşmanlık veya CCR1 20 genetik silinmesi ise, CCR5 20 veya CXCR3 21 patolojiye azaltmak vermedi, EAE patoloji azaltır. Bu nedenle, lökositler üzerinde belirli kemokin reseptörlerinin ifadesi MSS içine ikincisi infiltrasyonu için çok önemlidir ve EAE seyrini belirler.

Infiltre bağışıklık hücreleri, sırayla, enflamatuar süreç veya nöron 22 parçalanmasını teşvik, TNFa, IL-6 ve IL-1 gibi sitokinler, serbest, immün hücrelerin tüketiminin MS hastalar için etkili bir tedavi stratejisidir. Ayrıca, otomatikReaktif Th1 hücreleri sırayla TNFa, IL-1 ve IL-23 serbest bırakmak için makrofajları uyarır IFNy, bırakın.

Bu yazıda EAE, immün hücre dağılımı ve EAE farelerde çeşitli dokularda sitokin seviyeleri (mRNA) belirlenmesi indüklenmesini tarif etmektedir. Hücreler son CNS'de lezyon oluşumuna yol enflamatuar süreçlerin bir zamana bağlı bir genel bakış sağlamak amacıyla, hastalığın seyri sırasında farklı zaman noktalarında izole edilmiştir.

Protocol

ETİK TABLOSU: Bizim deneysel prosedürler Regierungspräsidium Darmstadt (Almanya) Etik Komitesi tarafından onaylanmış Ulusal ve Avrupa düzenlemelerine teyit edilmiştir. Tüm çabalar hayvan acı en aza indirmek ve kullanılan hayvanların sayısını azaltmak için yapılmıştır. 1. EAE Modeli EAE modeli indüksiyonu EAE uyarılması için 10 ila 13 haftalık dişi 129S4 / SvJae x C57BL / 6 fareleri kullanın. Üst içine farelere subkutan enjeksiyon ve…

Representative Results

Şekil 1, bu makalede açıklanan farklı yöntemler şematik bir bakış verir. 1) Fare MOG 35-55 antijen enjeksiyonu almak ve 10.7 ± 0.3 gün 28 sonra ilk klinik belirtiler gelişir. EAE farelerin bir temsilci hastalık kursu. Şekil 1'de 2) Çeşitli dokular (dalak, lenf düğümleri, bel omurilik) gösterilir ve kan preklinik faz (Günlük 2 gün 4 sırasında farklı zaman noktalarında ko…

Discussion

Burada anlatılan EAE modeli MS bir model olarak çok dikkat çeken ve rutin MS 32 için terapötik stratejilerin test kullanılır. Fare hastalık MS'in birçok klinik ve histolojik özellikleri sergiler ve nöronal antijenlere otoimmünite indüksiyon kaynaklanır. miyelin antijenlerine sensitizasyon CNS, kan-beyin bariyeri bozukluğu ve böylece, bağışıklık hücresi infiltrasyonu ile ilişkilidir. Bulgularımız, bağışıklık hücreleri, akut fazda lenf nodlarında geçici artış olduğunu gö…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Else Kröner-Fresenius Foundation (EKFS) Research Training Group Translational Research Innovation – Pharma (TRIP) and by the “Landesoffensive zur Entwicklung wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz (LOEWE), Schwerpunkt: Anwendungsorientierte Arzneimittelforschung” of the State of Hesse.

Materials

ABI Prism 7500 Sequence Detection System  Applied Biosystems, Austin, USA quantitative PCR system
Accutase Sigma Aldrich Munich, Germany A6964 cell detachment solution
CD3-PE-CF594 BD, Heidelberg, Germany 562286
CD4-V500 BD, Heidelberg, Germany 560782
CD8-eFluor650 eBioscience, Frankfurt, Germany 95-0081-42
CD11b-eFluor605 eBioscience, Frankfurt, Germany 93-0112-42
CD11c-AlexaFluor700 BD, Heidelberg, Germany 560583
CD19-APC-H7  BD, Heidelberg, Germany 560143
CD45-Vioblue  Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany 130-092-910
CompBeads BD, Heidelberg, Germany 552843 compensation beads
Collagenase A Sigma Aldrich Munich, Germany C0130
Cytometric absolute count standard  Polyscience, Eppelheim, Germany BLI-580-10
Cytometer Setup and Tracking beads  BD, Heidelberg, Germany 642412
DNase I Sigma Aldrich Munich, Germany D5025
EAE Kit Hooke Laboratories, Lawrence, USA EK2110
F4/80-PE-Cy7  BioLegend, Fell, Germany 123114
First Strand cDNA-Synthesis kit  Thermo Scientific, Schwerte, Germany K1612
Fc receptor-1 blocking buffer  Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany 130-092-575
Flow cytometric absolute count standard Polyscience, Eppelheim, Germany 580
FlowJo software v10  Treestar, Ashland, USA flow cytometry software
LSRII/Fortessa  BD, Heidelberg, Germany flow cytometer
Ly6G-APC-Cy7  BD, Heidelberg, Germany 560600
Lysing solution  BD, Heidelberg, Germany 349202
Maxima SYBR Green  Thermo Scientific, Schwerte, Germany K0221 fluorescent DNA binding dye 
RNeasy Mini Kit  Qiagen, Hilden, Germany 74104 RNA extraction kit
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McFarland, H. F., Martin, R. Multiple sclerosis: a complicated picture of autoimmunity. Nat Immunol. 8, 913-919 (2007).
  2. Proudfoot, A. E. Chemokine receptors: multifaceted therapeutic targets. Nat Rev Immunol. 2, 106-115 (2002).
  3. Mihara, M., Hashizume, M., Yoshida, H., Suzuki, M., Shiina, M. IL-6/IL-6 receptor system and its role in physiological and pathological conditions. Clin Sci (Lond). 122, 143-159 (2012).
  4. Strydom, N., Rankin, S. M. Regulation of circulating neutrophil numbers under homeostasis and in disease. J Innate Immun. 5, 304-314 (2013).
  5. Kerstetter, A. E., Padovani-Claudio, D. A., Bai, L., Miller, R. H. Inhibition of CXCR2 signaling promotes recovery in models of multiple sclerosis. Exp Neurol. 220, 44-56 (2009).
  6. Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13, 159-175 (2013).
  7. Fan, X., et al. Murine CXCR1 is a functional receptor for GCP-2/CXCL6 and interleukin-8/CXCL8. J Biol Chem. 282, 11658-11666 (2007).
  8. Hartl, D., et al. Infiltrated neutrophils acquire novel chemokine receptor expression and chemokine responsiveness in chronic inflammatory lung diseases. J Immunol. 181, 8053-8067 (2008).
  9. Barcelos, L. S., et al. Role of the chemokines CCL3/MIP-1 alpha and CCL5/RANTES in sponge-induced inflammatory angiogenesis in mice. Microvasc Res. 78, 148-154 (2009).
  10. Wojkowska, D. W., Szpakowski, P., Ksiazek-Winiarek, D., Leszczynski, M., Glabinski, A. Interactions between neutrophils, Th17 cells, and chemokines during the initiation of experimental model of multiple sclerosis. Mediators Inflamm. , 590409 (2014).
  11. Bose, S., Cho, J. Role of chemokine CCL2 and its receptor CCR2 in neurodegenerative diseases. Arch Pharm Res. 36, 1039-1050 (2013).
  12. Mony, J. T., Khorooshi, R., Owens, T. Chemokine receptor expression by inflammatory T cells in EAE. Front Cell Neurosci. 8, 187 (2014).
  13. Katschke, K. J., et al. Differential expression of chemokine receptors on peripheral blood, synovial fluid, and synovial tissue monocytes/macrophages in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 44, 1022-1032 (2001).
  14. Trebst, C., et al. CCR1+/CCR5+ mononuclear phagocytes accumulate in the central nervous system of patients with multiple sclerosis. Am J Pathol. 159, 1701-1710 (2001).
  15. Karin, N., Wildbaum, G. The role of chemokines in adjusting the balance between CD4+ effector T cell subsets and FOXp3-negative regulatory T cells. Int Immunopharmacol. , (2015).
  16. Rottman, J. B., et al. Leukocyte recruitment during onset of experimental allergic encephalomyelitis is CCR1 dependent. Eur J Immunol. 30, 2372-2377 (2000).
  17. Izikson, L., Klein, R. S., Charo, I. F., Weiner, H. L., Luster, A. D. Resistance to experimental autoimmune encephalomyelitis in mice lacking the CC chemokine receptor (CCR)2. J Exp Med. 192, 1075-1080 (2000).
  18. Kuwabara, T., et al. CCR7 ligands are required for development of experimental autoimmune encephalomyelitis through generating IL-23-dependent Th17 cells. J Immunol. 183, 2513-2521 (2009).
  19. Liu, L., et al. Myelin repair is accelerated by inactivating CXCR2 on nonhematopoietic cells. J Neurosci. 30, 9074-9083 (2010).
  20. Matsui, M., et al. Treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis with the chemokine receptor antagonist Met-RANTES. J Neuroimmunol. 128, 16-22 (2002).
  21. Liu, L., et al. Severe disease, unaltered leukocyte migration, and reduced IFN-gamma production in CXCR3-/- mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol. 176, 4399-4409 (2006).
  22. Lee, M., Suk, K., Kang, Y., McGeer, E., McGeer, P. L. Neurotoxic factors released by stimulated human monocytes and THP-1 cells. Brain Res. 1400, 99-111 (2011).
  23. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. , (2012).
  24. O’Connor, R. A., et al. Adjuvant immunotherapy of experimental autoimmune encephalomyelitis: immature myeloid cells expressing CXCL10 and CXCL16 attract CXCR3+CXCR6+ and myelin-specific T cells to the draining lymph nodes rather than the central nervous system. J Immunol. 188, 2093-2101 (2012).
  25. Olesch, C., et al. MPGES-1-derived PGE2 suppresses CD80 expression on tumor-associated phagocytes to inhibit anti-tumor immune responses in breast cancer. Oncotarget. 6, 10284-10296 (2015).
  26. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 162, 156-159 (1987).
  27. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25, 402-408 (2001).
  28. Barthelmes, J., et al. Lack of ceramide synthase 2 suppresses the development of experimental autoimmune encephalomyelitis by impairing the migratory capacity of neutrophils. Brain Behav Immun. 46, 280-292 (2015).
  29. Schiffmann, S., et al. Ceramide synthase 6 plays a critical role in the development of experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol. 188, 5723-5733 (2012).
  30. Schiffmann, S., et al. PGE2/EP4 signaling in peripheral immune cells promotes development of experimental autoimmune encephalomyelitis. Biochem Pharmacol. 87, 625-635 (2014).
  31. Giglio, S., Monis, P. T., Saint, C. P. Demonstration of preferential binding of SYBR Green I to specific DNA fragments in real-time multiplex PCR. Nucleic Acids Res. 31, e136 (2003).
  32. Vesterinen, H. M., et al. Improving the translational hit of experimental treatments in multiple sclerosis. Mult Scler. 16, 1044-1055 (2010).
  33. ‘t Hart, B. A., Gran, B., Weissert, R. EAE: imperfect but useful models of multiple sclerosis. Trends Mol Med. 17, 119-125 (2011).
  34. Serada, S., et al. IL-6 blockade inhibits the induction of myelin antigen-specific Th17 cells and Th1 cells in experimental autoimmune encephalomyelitis. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 9041-9046 (2008).
  35. Berer, K., et al. Commensal microbiota and myelin autoantigen cooperate to trigger autoimmune demyelination. Nature. 479, 538-541 (2011).
  36. Shetty, A., et al. Immunodominant T-cell epitopes of MOG reside in its transmembrane and cytoplasmic domains in EAE. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 1, 22-22 (2014).
  37. Schmitz, K., et al. R-flurbiprofen attenuates experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. EMBO Mol Med. 6, 1398-1422 (2014).
  38. Procaccini, C., De Rosa, V., Pucino, V., Formisano, L., Matarese, G. Animal models of Multiple Sclerosis. Eur J Pharmacol. 759, 182-191 (2015).
  39. Pollinger, B., et al. Spontaneous relapsing-remitting EAE in the SJL/J mouse: MOG-reactive transgenic T cells recruit endogenous MOG-specific B cells. J Exp Med. 206, 1303-1316 (2009).
  40. Rodriguez, M., Oleszak, E., Leibowitz, J. Theiler’s murine encephalomyelitis: a model of demyelination and persistence of virus. Crit Rev Immunol. 7, 325-365 (1987).
  41. Lipton, H. L. Theiler’s virus infection in mice: an unusual biphasic disease process leading to demyelination. Infect Immun. 11, 1147-1155 (1975).
  42. Matsushima, G. K., Morell, P. The neurotoxicant, cuprizone, as a model to study demyelination and remyelination in the central nervous system. Brain Pathol. 11, 107-116 (2001).
  43. El-behi, M., Rostami, A., Ciric, B. Current views on the roles of Th1 and Th17 cells in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroimmune Pharmacol. 5, 189-197 (2010).
  44. Mann, M. K., Ray, A., Basu, S., Karp, C. L., Dittel, B. N. Pathogenic and regulatory roles for B cells in experimental autoimmune encephalomyelitis. Autoimmunity. 45, 388-399 (2012).
  45. Lassmann, H., Bruck, W., Lucchinetti, C. F. The immunopathology of multiple sclerosis: an overview. Brain Pathol. 17, 210-218 (2007).
  46. Simmons, S. B., Pierson, E. R., Lee, S. Y., Goverman, J. M. Modeling the heterogeneity of multiple sclerosis in animals. Trends Immunol. 34, 410-422 (2013).
  47. Praet, J., Guglielmetti, C., Berneman, Z., Vander Linden, A., Ponsaerts, P. Cellular and molecular neuropathology of the cuprizone mouse model: clinical relevance for multiple sclerosis. Neurosci Biobehav Rev. 47, 485-505 (2014).

Tags

Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE)Multiple SclerosisDemyelinationImmune Cell InfiltrationMiceMyelin Oligodendrocyte GlycoproteinComplete Freund’s AdjuvantPertussis ToxinLymph NodeSpinal CordClinical Symptoms

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Barthelmes, J., Tafferner, N., Kurz, J., de Bruin, N., Parnham, M. J., Geisslinger, G., Schiffmann, S. Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues. J. Vis. Exp. (111), e53933, doi:10.3791/53933 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image