אינדוקציה של ניסיוני אוטואימוניות Encephalomyelitis עכברים וההערכה של הפצת מחלות התלויה של תאים חיסוניים ברקמות שונות
Summary
This manuscript describes the methods for induction and scoring of the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model, together with the assessment of immune cell distribution and mRNA cytokine levels in lymph nodes, spleen, blood and spinal cord using flow cytometry and quantitative PCR, respectively, at various disease phases.
Abstract
טרשת נפוצה, חזקה כי מחלה אוטואימונית דלקתית, המאופיינת היווצרות הנגע במערכת העצבים המרכזית (CNS) וכתוצאה מכך פגיעה קוגניטיבית ומוטורית. encephalomyelitis אוטואימוניות ניסויית (EAE) הוא מודל יצור מועיל של MS, כי זה מאופיין אף הוא היווצרות הנגע של מערכת העצבים המרכזית, לקויות מוטוריות, והוא מונע גם על ידי תגובות אוטואימוניות ודלקתיות. אחד הדגמים EAE מושרה עם פפטיד נגזר חלבון oligodendrocyte המיאלין (ש"א) 35-55 בעכברים. עכברי EAE לפתח קורס מחלה מתקדם. קורס זה מחולק לשלושה שלבים: השלב הפרה-קליניים (יום 9 – 0), הופעת המחלה (יום 10 – 11) ואת השלב האקוטי (יום 12 – 14). טרשת נפוצה EAE הם המושרה על ידי תאי T אוטוריאקטיבים כי להסתנן CNS. תאי T אלה מפרישים כמוקינים וציטוקינים אשר להוביל גיוס של תאים חיסוניים נוספים. לכן, חלוקת התא החיסונית ד חוט השדרהuring נחקר בשלושה שלבי מחלה. כדי להדגיש את נקודת הזמן של המחלה שבה הפעלה / התפשטות / הצטברות של תאי T, B תאים מונוציטים מתחיל, חלוקת תא החיסון בבלוטות הלימפה, הטחול ודם הוערכה גם. יתר על כן, רמות ציטוקינים כמה (IL-1β, IL-6, IL-23, TNFα, IFNγ) בשלושת שלבי המחלה נקבעו, כדי לקבל תובנות לגבי תהליכים דלקתיים של המחלה. לסיכום, הנתונים מספקים סקירה של הפרופיל התפקודי של תאים חיסוניים במהלך פתולוגיה EAE.
Introduction
טרשת נפוצה (MS) ו במודל החיה המתאים לו, encephalomyelitis אוטואימוניות ניסוי (EAE), להראות שינויי neuroinflammation אוטואימוניות של מערכת העצבים המרכזית (CNS). מוקדם פעיל נגעים MS ו EAE מאופיינים על ידי נוכחות של תאים חיסוניים הסתננו. האטיולוגיה של MS נותר עלום, אבל היא נחשבת לערב חורבן המיאלין בתיווך תאי T אוטוריאקטיבים. תאי T אוטוריאקטיבים אלה מפרישים ציטוקינים פרו-דלקתיים וכמוקינים אשר מושכים תאים חיסוניים אחרים, כגון תאי B, מונוציטים ו נויטרופילים מהמחזור. מונוציטים להתמיין מקרופאגים. גמא אינטרפרון (IFNγ) מופרש על ידי תאי T אוטוריאקטיבים מקטב את מקרופאגים לתוך מקרופאגים פרו-דלקתיים. הציטוקינים שחרור מקרופאגים פרו-דלקתי מיני חמצן תגובתי מקדמי אפופטוזיס oligodendrocytes. מותו של oligodendrocytes מוביל demyelination. יתר על כן, תאי B להתמיין pתאים lasma ונוגדנים עצמיים השחרור בפועל כנגד מעטפת המיאלין, בסופו של דבר וכתוצאה מכך השפלה של המיאלין. ההפסד של המיאלין מוביל לזילות של אקסונים נוירונים ובכך להיווצרות של אתרי הנגע של מערכת העצבים המרכזית אשר מייצגים את המאפיין העיקרי של MS 1. בפריפריה, תאי T ותאי B מופעלים בקשרי הלימפה, הם מתרבים הטחול ולהעביר דרך מערכת הדם למערכת העצבים המרכזית. מונוציטים ו נויטרופילים להתרבות במח העצם וגם להעביר דרך מערכת הדם למערכת העצבים המרכזית.
לויקוציטים extravasation ממח העצם, הטחול בלוטות לימפה לתוך הדם או ממחזור הדם אל מערכת העצבים המרכזית היא תהליך רב שלבי, כי תלוי במספר גורמים, כולל אינטראקציות מולקולריות בין לויקוציטים האנדותל בתיווך כמוקינים ואת קולטני chemokine. ההפקה של כמוקינים על ידי תאים מסוגים שונים יכול להיגרם במהלך reactio החיסוניתn על ידי ציטוקינים כמו-α tumor necrosis factor (TNFα), IFNγ ו- interleukin-6 (IL-6), אשר לאחר מכן מגייס תאי מערכת החיסון לאתר של דלקת 2,3. תאים חיסוניים להציג קבוצת משנה של קולטני chemokine על פני השטח שלהם, בהתאם לסוג תא מסלול הגירה לאתר הדלקתי. לפיכך, CXCR2, CCR1 ו CXCR1 באים לידי ביטוי על נויטרופילים בוגר במח עצם ודם 4, ומחייבת של הליגנדים שלה, CXCL2, CCL5 או CXCL6, בהתאמה, מפעיל נויטרופילים ומקדם ההידבקות שלהם כדי האנדותל ובהמשך, נדידת התאים לרקמות 5-9. CCL2 ו CCL20 למשוך מונוציטים ו Th1 / TH17 תאים 10, המבטאים CCR2 11 ו CCR6 12, בהתאמה. CCR1 ו CCR5, שהביעו תאים מסוגים שונים, כולל תאי T, מונוציטים ומקרופגים 13, לאגד CCL3, CCL5 ו CCL7 והם שהוגברו במהלך MS 14. CXCR3 מתבטא על תאי T ונקשר CCL9, CCL10 וCCL11 15.
אחת האסטרטגיה העיקרית בטיפול טרשת נפוצה היא דלדול של תאי מערכת החיסון או למניעת הסתננות תא החיסון לתוך מערכת העצבים המרכזית. לכן, המצור של קולטני chemokine ספציפית נחקר EAE. אנטגוניזם או מחיקה גנטית של CCR1 16, 17 CCR2, CCR7 18 או CXCR2 19 מפחית פתולוגיה EAE, ואילו אנטגוניזם או מחיקה גנטית של CCR1 20, CCR5 20 או CXCR3 21 לא הפחית את הפתולוגיה. לפיכך, הביטוי של קולטנים chemokine הספציפיים על לויקוציטים הוא חיוני עבור החדירה של האחרון לתוך מערכת העצבים המרכזית ואת מכתיב את מהלך EAE.
הדלדול של תאי מערכת חיסון הוא אסטרטגית טיפול יעיל בחולי טרשת נפוצה, כי תאי חיסון הסתננו לשחרר ציטוקינים, כגון TNFα, IL-6 ו- IL-1β, אשר, בתורו, לקדם את התהליך הדלקתי או השפלה של נוירונים 22. יתר על כן, וקישוט רכבתאי Th1 תגובתי לשחרר IFNγ, שבתורן גורמות מקרופאגים לשחרר TNFα, IL-1β ו- IL-23.
כתב יד זה מתאר את האינדוקציה של EAE, קביעת חלוקת תא החיסון ואת רמות ציטוקינים (mRNA) ברקמות שונות בעכברים EAE. תאים בודדו בנקודות זמן שונות במהלך המחלה לספק סקירה תלוי זמן של תהליכים דלקתיים אשר בסופו של דבר להוביל להיווצרות הנגע של מערכת העצבים המרכזית.
Protocol
Representative Results
Discussion
המודל EAE המתואר כאן קיבל את עיקר תשומת הלב כמודל של MS והוא משמש באופן שגרתי בבדיקת אסטרטגיות טיפוליות עבור MS 32. מחל העכבר מפגינה הרבה מאפיינים קליניים היסטולוגית של טרשת נפוצה נגרמת על ידי אינדוקצית אוטואימיוניות לאנטיגנים עצבי. סנסיטיזציה לאנטיגנים המיאלין ה?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Else Kröner-Fresenius Foundation (EKFS) Research Training Group Translational Research Innovation – Pharma (TRIP) and by the “Landesoffensive zur Entwicklung wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz (LOEWE), Schwerpunkt: Anwendungsorientierte Arzneimittelforschung” of the State of Hesse.
Materials
| ABI Prism 7500 Sequence Detection System | Applied Biosystems, Austin, USA | quantitative PCR system | |
| Accutase | Sigma Aldrich Munich, Germany | A6964 | cell detachment solution |
| CD3-PE-CF594 | BD, Heidelberg, Germany | 562286 | |
| CD4-V500 | BD, Heidelberg, Germany | 560782 | |
| CD8-eFluor650 | eBioscience, Frankfurt, Germany | 95-0081-42 | |
| CD11b-eFluor605 | eBioscience, Frankfurt, Germany | 93-0112-42 | |
| CD11c-AlexaFluor700 | BD, Heidelberg, Germany | 560583 | |
| CD19-APC-H7 | BD, Heidelberg, Germany | 560143 | |
| CD45-Vioblue | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-910 | |
| CompBeads | BD, Heidelberg, Germany | 552843 | compensation beads |
| Collagenase A | Sigma Aldrich Munich, Germany | C0130 | |
| Cytometric absolute count standard | Polyscience, Eppelheim, Germany | BLI-580-10 | |
| Cytometer Setup and Tracking beads | BD, Heidelberg, Germany | 642412 | |
| DNase I | Sigma Aldrich Munich, Germany | D5025 | |
| EAE Kit | Hooke Laboratories, Lawrence, USA | EK2110 | |
| F4/80-PE-Cy7 | BioLegend, Fell, Germany | 123114 | |
| First Strand cDNA-Synthesis kit | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | K1612 | |
| Fc receptor-1 blocking buffer | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-575 | |
| Flow cytometric absolute count standard | Polyscience, Eppelheim, Germany | 580 | |
| FlowJo software v10 | Treestar, Ashland, USA | flow cytometry software | |
| LSRII/Fortessa | BD, Heidelberg, Germany | flow cytometer | |
| Ly6G-APC-Cy7 | BD, Heidelberg, Germany | 560600 | |
| Lysing solution | BD, Heidelberg, Germany | 349202 | |
| Maxima SYBR Green | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | K0221 | fluorescent DNA binding dye |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | RNA extraction kit |
References
- McFarland, H. F., Martin, R. Multiple sclerosis: a complicated picture of autoimmunity. Nat Immunol. 8, 913-919 (2007).
- Proudfoot, A. E. Chemokine receptors: multifaceted therapeutic targets. Nat Rev Immunol. 2, 106-115 (2002).
- Mihara, M., Hashizume, M., Yoshida, H., Suzuki, M., Shiina, M. IL-6/IL-6 receptor system and its role in physiological and pathological conditions. Clin Sci (Lond). 122, 143-159 (2012).
- Strydom, N., Rankin, S. M. Regulation of circulating neutrophil numbers under homeostasis and in disease. J Innate Immun. 5, 304-314 (2013).
- Kerstetter, A. E., Padovani-Claudio, D. A., Bai, L., Miller, R. H. Inhibition of CXCR2 signaling promotes recovery in models of multiple sclerosis. Exp Neurol. 220, 44-56 (2009).
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13, 159-175 (2013).
- Fan, X., et al. Murine CXCR1 is a functional receptor for GCP-2/CXCL6 and interleukin-8/CXCL8. J Biol Chem. 282, 11658-11666 (2007).
- Hartl, D., et al. Infiltrated neutrophils acquire novel chemokine receptor expression and chemokine responsiveness in chronic inflammatory lung diseases. J Immunol. 181, 8053-8067 (2008).
- Barcelos, L. S., et al. Role of the chemokines CCL3/MIP-1 alpha and CCL5/RANTES in sponge-induced inflammatory angiogenesis in mice. Microvasc Res. 78, 148-154 (2009).
- Wojkowska, D. W., Szpakowski, P., Ksiazek-Winiarek, D., Leszczynski, M., Glabinski, A. Interactions between neutrophils, Th17 cells, and chemokines during the initiation of experimental model of multiple sclerosis. Mediators Inflamm. , 590409 (2014).
- Bose, S., Cho, J. Role of chemokine CCL2 and its receptor CCR2 in neurodegenerative diseases. Arch Pharm Res. 36, 1039-1050 (2013).
- Mony, J. T., Khorooshi, R., Owens, T. Chemokine receptor expression by inflammatory T cells in EAE. Front Cell Neurosci. 8, 187 (2014).
- Katschke, K. J., et al. Differential expression of chemokine receptors on peripheral blood, synovial fluid, and synovial tissue monocytes/macrophages in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 44, 1022-1032 (2001).
- Trebst, C., et al. CCR1+/CCR5+ mononuclear phagocytes accumulate in the central nervous system of patients with multiple sclerosis. Am J Pathol. 159, 1701-1710 (2001).
- Karin, N., Wildbaum, G. The role of chemokines in adjusting the balance between CD4+ effector T cell subsets and FOXp3-negative regulatory T cells. Int Immunopharmacol. , (2015).
- Rottman, J. B., et al. Leukocyte recruitment during onset of experimental allergic encephalomyelitis is CCR1 dependent. Eur J Immunol. 30, 2372-2377 (2000).
- Izikson, L., Klein, R. S., Charo, I. F., Weiner, H. L., Luster, A. D. Resistance to experimental autoimmune encephalomyelitis in mice lacking the CC chemokine receptor (CCR)2. J Exp Med. 192, 1075-1080 (2000).
- Kuwabara, T., et al. CCR7 ligands are required for development of experimental autoimmune encephalomyelitis through generating IL-23-dependent Th17 cells. J Immunol. 183, 2513-2521 (2009).
- Liu, L., et al. Myelin repair is accelerated by inactivating CXCR2 on nonhematopoietic cells. J Neurosci. 30, 9074-9083 (2010).
- Matsui, M., et al. Treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis with the chemokine receptor antagonist Met-RANTES. J Neuroimmunol. 128, 16-22 (2002).
- Liu, L., et al. Severe disease, unaltered leukocyte migration, and reduced IFN-gamma production in CXCR3-/- mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol. 176, 4399-4409 (2006).
- Lee, M., Suk, K., Kang, Y., McGeer, E., McGeer, P. L. Neurotoxic factors released by stimulated human monocytes and THP-1 cells. Brain Res. 1400, 99-111 (2011).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. , (2012).
- O’Connor, R. A., et al. Adjuvant immunotherapy of experimental autoimmune encephalomyelitis: immature myeloid cells expressing CXCL10 and CXCL16 attract CXCR3+CXCR6+ and myelin-specific T cells to the draining lymph nodes rather than the central nervous system. J Immunol. 188, 2093-2101 (2012).
- Olesch, C., et al. MPGES-1-derived PGE2 suppresses CD80 expression on tumor-associated phagocytes to inhibit anti-tumor immune responses in breast cancer. Oncotarget. 6, 10284-10296 (2015).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 162, 156-159 (1987).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25, 402-408 (2001).
- Barthelmes, J., et al. Lack of ceramide synthase 2 suppresses the development of experimental autoimmune encephalomyelitis by impairing the migratory capacity of neutrophils. Brain Behav Immun. 46, 280-292 (2015).
- Schiffmann, S., et al. Ceramide synthase 6 plays a critical role in the development of experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol. 188, 5723-5733 (2012).
- Schiffmann, S., et al. PGE2/EP4 signaling in peripheral immune cells promotes development of experimental autoimmune encephalomyelitis. Biochem Pharmacol. 87, 625-635 (2014).
- Giglio, S., Monis, P. T., Saint, C. P. Demonstration of preferential binding of SYBR Green I to specific DNA fragments in real-time multiplex PCR. Nucleic Acids Res. 31, e136 (2003).
- Vesterinen, H. M., et al. Improving the translational hit of experimental treatments in multiple sclerosis. Mult Scler. 16, 1044-1055 (2010).
- ‘t Hart, B. A., Gran, B., Weissert, R. EAE: imperfect but useful models of multiple sclerosis. Trends Mol Med. 17, 119-125 (2011).
- Serada, S., et al. IL-6 blockade inhibits the induction of myelin antigen-specific Th17 cells and Th1 cells in experimental autoimmune encephalomyelitis. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 9041-9046 (2008).
- Berer, K., et al. Commensal microbiota and myelin autoantigen cooperate to trigger autoimmune demyelination. Nature. 479, 538-541 (2011).
- Shetty, A., et al. Immunodominant T-cell epitopes of MOG reside in its transmembrane and cytoplasmic domains in EAE. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 1, 22-22 (2014).
- Schmitz, K., et al. R-flurbiprofen attenuates experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. EMBO Mol Med. 6, 1398-1422 (2014).
- Procaccini, C., De Rosa, V., Pucino, V., Formisano, L., Matarese, G. Animal models of Multiple Sclerosis. Eur J Pharmacol. 759, 182-191 (2015).
- Pollinger, B., et al. Spontaneous relapsing-remitting EAE in the SJL/J mouse: MOG-reactive transgenic T cells recruit endogenous MOG-specific B cells. J Exp Med. 206, 1303-1316 (2009).
- Rodriguez, M., Oleszak, E., Leibowitz, J. Theiler’s murine encephalomyelitis: a model of demyelination and persistence of virus. Crit Rev Immunol. 7, 325-365 (1987).
- Lipton, H. L. Theiler’s virus infection in mice: an unusual biphasic disease process leading to demyelination. Infect Immun. 11, 1147-1155 (1975).
- Matsushima, G. K., Morell, P. The neurotoxicant, cuprizone, as a model to study demyelination and remyelination in the central nervous system. Brain Pathol. 11, 107-116 (2001).
- El-behi, M., Rostami, A., Ciric, B. Current views on the roles of Th1 and Th17 cells in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroimmune Pharmacol. 5, 189-197 (2010).
- Mann, M. K., Ray, A., Basu, S., Karp, C. L., Dittel, B. N. Pathogenic and regulatory roles for B cells in experimental autoimmune encephalomyelitis. Autoimmunity. 45, 388-399 (2012).
- Lassmann, H., Bruck, W., Lucchinetti, C. F. The immunopathology of multiple sclerosis: an overview. Brain Pathol. 17, 210-218 (2007).
- Simmons, S. B., Pierson, E. R., Lee, S. Y., Goverman, J. M. Modeling the heterogeneity of multiple sclerosis in animals. Trends Immunol. 34, 410-422 (2013).
- Praet, J., Guglielmetti, C., Berneman, Z., Vander Linden, A., Ponsaerts, P. Cellular and molecular neuropathology of the cuprizone mouse model: clinical relevance for multiple sclerosis. Neurosci Biobehav Rev. 47, 485-505 (2014).
