JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Inductie van experimentele auto-immune Encefalomyelitis in Muizen en evaluatie van de ziekte-afhankelijke Verdeling van immuuncellen in verschillende weefsels

Published: May 08, 2016
doi:
10.3791/53933
, , , , , ,
1Institute of Clinical Pharmacology,Goethe University Hospital Frankfurt, 2Project Group for Translational Medicine & Pharmacology,Fraunhofer IME

Summary

This manuscript describes the methods for induction and scoring of the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model, together with the assessment of immune cell distribution and mRNA cytokine levels in lymph nodes, spleen, blood and spinal cord using flow cytometry and quantitative PCR, respectively, at various disease phases.

Abstract

Multiple sclerose wordt als een autoimmune ziekte, die wordt gekenmerkt door laesievorming in het centrale zenuwstelsel (CNS) leidt tot cognitieve en motorische stoornissen zijn. Experimentele autoimmuun encefalomyelitis (EAE) een nuttig diermodel van MS, omdat het ook gekenmerkt door laesievorming in het CNS, motorische beschadiging en wordt ook aangedreven door auto-immuunziekten en inflammatoire reacties. Een van de modellen EAE wordt geïnduceerd met een peptide afgeleid van myeline oligodendrocyt-eiwit (MOG) 35-55 bij muizen. De EAE muizen ontwikkelen een progressieve ziekte natuurlijk. Deze cursus is verdeeld in drie fasen: de preklinische fase (dag 0-9), het begin van de ziekte (dag 10 – 11) en de acute fase (dag 12 – 14). MS en EAE geïnduceerd door autoreactieve T-cellen die infiltreren het CZS. Deze T-cellen scheiden chemokines en cytokines die leiden tot de aanwerving van verdere immuuncellen. Daarom is de immune celverdeling in het ruggenmerg dijdens de drie fasen ziekte onderzocht. Het tijdstip van de ziekte waarop de activering / proliferatie / accumulatie van T-cellen, B-cellen en monocyten begint markeren werd de immuuncel verdeling lymfklieren, milt en bloed ook beoordeeld. Bovendien voert de verschillende cytokines (IL-1β, IL-6, IL-23, TNFa, IFNy) in de drie ziekte fasen werden bepaald, inzicht in de ontstekingsprocessen van de ziekte. Concluderend, de data geven een overzicht van de functionele profiel van immuuncellen in EAE pathologie.

Introduction

Multiple sclerose (MS) en de bijbehorende diermodel, experimentele autoimmuun encefalomyelitis (EAE), tonen autoimmune neuroinflammatie veranderingen in het centrale zenuwstelsel (CNS). Vroege actieve MS en EAE letsels worden gekenmerkt door de aanwezigheid van geïnfiltreerde immuuncellen. De etiologie van MS nog steeds onbekend, maar wordt algemeen beschouwd als de vernietiging van myeline gemedieerd door autoreactieve T-cellen omvatten. Deze autoreactieve T-cellen scheiden cytokines en chemokines die andere immune cellen zoals B cellen, monocyten en neutrofielen uit de circulatie te trekken. Monocyten differentiëren tot macrofagen. Interferon gamma (IFNy) uitgescheiden door autoreactieve T cellen polariseert de macrofagen in pro-inflammatoire macrofagen. De pro-inflammatoire cytokinen macrofagen afgifte en reactieve zuurstofdeeltjes die apoptose in oligodendrocyten te bevorderen. De dood van de oligodendrocyten leidt tot demyelinisatie. Voorts B-cellen differentiëren tot pLasma cellen en afgifte autoantilichamen tegen de myelineschede, uiteindelijk leidt tot afbraak van myeline. Het verlies van myeline leidt tot afbraak van axonen en neuronen en daardoor de vorming van laesie plaatsen in het CZS die de belangrijkste kenmerk van MS 1 vertegenwoordigen. In de periferie, worden T-cellen en B-cellen geactiveerd in de lymfeklieren, ze prolifereren in de milt en migreren door de circulatie in het centrale zenuwstelsel. Monocyten en neutrofielen prolifereren in het beenmerg en ook migreren door de circulatie in het centrale zenuwstelsel.

Leukocytextravasatie uit beenmerg, milt en lymfeknopen in het bloed of uit de bloedstroom in het centraal zenuwstelsel is een meerstaps proces dat afhankelijk is van verschillende factoren, waaronder moleculaire interacties tussen leukocyten en endotheel gemedieerd door chemokines en chemokinereceptoren. De productie van chemokinen van verschillende celtypen kunnen worden geïnduceerd tijdens de immune keuze reactietijdn door cytokinen zoals tumornecrosefactor-α (TNFa), IFNy en interleukine-6 ​​(IL-6), die vervolgens rekruteert immuuncellen naar de plaats van ontsteking 2,3. Immune cellen vormen een subset van chemokine receptoren op hun oppervlak, afhankelijk van het celtype en migratie pad naar de ontstekingsplaats. Aldus CXCR2, CCR1 en CXCR1 uitgedrukt op rijpe neutrofielen in het beenmerg en bloed 4 en binding van de liganden, CXCL2, CCL5 of CXCL6 respectievelijk activeert neutrofielen en bevordert hechting aan het endotheel en vervolgens de migratie van de cellen in de weefsels 5-9. CCL2 en CCL20 trekken monocyten en Th1 / Th17 cellen 10, die CCR2 11 en CCR6 12 respectievelijk uit te drukken,. CCR1 en CCR5, door verschillende celtypen, waaronder T-cellen, monocyten en macrofagen 13 uitgedrukt, binden CCL3, CCL5 en CCL7 en worden opgereguleerd tijdens MS-14. CXCR3 wordt uitgedrukt op T-cellen en bindt CCL9, CCL10 enCCL11 15.

Een belangrijkste strategie bij MS behandeling is de uitputting van immuuncellen of voorkomen van immuuncellen infiltratie in het CNS. Daarom heeft de blokkade van specifieke chemokine receptoren onderzocht in EAE. Antagonisme of genetische deletie van CCR1 16, CCR2 17, CCR7 18 of CXCR2 19 vermindert EAE pathologie, terwijl antagonisme of genetische deletie van CCR1 20, leverde CCR5 20 of CXCR3 21 niet de pathologie te verminderen. Daarom is de expressie van specifieke chemokine receptoren op leukocyten is cruciaal voor de infiltratie van de laatste in het CZS en bepaalt het verloop van EAE.

De uitputting van immuuncellen is een effectieve behandelingsstrategie voor MS-patiënten, omdat geïnfiltreerd immune cellen geven cytokines zoals TNFa, IL-6 en IL-1β, die op zijn beurt het bevorderen ontstekingsproces of afbraak van 22 neuronen. Bovendien auto-reactieve Th1 cellen geven IFNy, die op zijn beurt stimuleert macrofagen TNFa, IL-1β en IL-23 vrij.

Dit manuscript beschrijft de inductie van EAE, het bepalen van de immune celverdeling en cytokine niveaus (mRNA) in verschillende weefsels in muizen EAE. Cellen werden op verschillende tijdstippen die in het ziekteverloop een tijdsafhankelijke overzicht van inflammatoire processen die uiteindelijk leiden tot laesievorming in het CZS verschaffen.

Protocol

ETHIEK STATEMENT: Onze experimentele procedures worden goedgekeurd door de ethische commissie van het Regierungspräsidium Darmstadt (Duitsland) en bevestigen om nationale en Europese regelgeving. Alle inspanningen werden gedaan om het dierenleed te beperken en het aantal gebruikte dieren te verminderen. 1. EAE Model Inductie van de EAE model Gebruik 10- tot 13-weken oude vrouwelijke 129S4 / SvJae x C57BL / 6 muizen voor de inductie van EAE. Geven de muizen een …

Representative Results

Figuur 1 geeft een schematisch overzicht van de verschillende methoden beschreven in dit artikel. 1) Muizen krijgen een injectie van MOG 35-55 antigen en de ontwikkeling van de eerste klinische symptomen na 10,7 ± 0,3 dagen 28. Een vertegenwoordiger ziekteverloop van EAE muizen wordt weergegeven in figuur 1. 2) verschillende weefsels (milt, lymfeknopen, lumbale ruggenmerg) en bloed worden uit contr…

Discussion

EAE model beschreven heeft de meeste aandacht gekregen als een model van MS en wordt routinematig gebruikt in het testen van therapeutische strategieën voor MS 32. De muis ziekte vertoont vele klinische en histologische kenmerken van MS en wordt veroorzaakt door de inductie van autoimmuniteit neuronale antigenen. Sensibilisatie tegen myeline antigenen geassocieerd met bloed hersenbarrière disfunctioneren en daardoor immune cel infiltratie in het CNS. Onze resultaten tonen aan dat immuuncellen verhogen tijde…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Else Kröner-Fresenius Foundation (EKFS) Research Training Group Translational Research Innovation – Pharma (TRIP) and by the “Landesoffensive zur Entwicklung wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz (LOEWE), Schwerpunkt: Anwendungsorientierte Arzneimittelforschung” of the State of Hesse.

Materials

ABI Prism 7500 Sequence Detection System  Applied Biosystems, Austin, USA quantitative PCR system
Accutase Sigma Aldrich Munich, Germany A6964 cell detachment solution
CD3-PE-CF594 BD, Heidelberg, Germany 562286
CD4-V500 BD, Heidelberg, Germany 560782
CD8-eFluor650 eBioscience, Frankfurt, Germany 95-0081-42
CD11b-eFluor605 eBioscience, Frankfurt, Germany 93-0112-42
CD11c-AlexaFluor700 BD, Heidelberg, Germany 560583
CD19-APC-H7  BD, Heidelberg, Germany 560143
CD45-Vioblue  Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany 130-092-910
CompBeads BD, Heidelberg, Germany 552843 compensation beads
Collagenase A Sigma Aldrich Munich, Germany C0130
Cytometric absolute count standard  Polyscience, Eppelheim, Germany BLI-580-10
Cytometer Setup and Tracking beads  BD, Heidelberg, Germany 642412
DNase I Sigma Aldrich Munich, Germany D5025
EAE Kit Hooke Laboratories, Lawrence, USA EK2110
F4/80-PE-Cy7  BioLegend, Fell, Germany 123114
First Strand cDNA-Synthesis kit  Thermo Scientific, Schwerte, Germany K1612
Fc receptor-1 blocking buffer  Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany 130-092-575
Flow cytometric absolute count standard Polyscience, Eppelheim, Germany 580
FlowJo software v10  Treestar, Ashland, USA flow cytometry software
LSRII/Fortessa  BD, Heidelberg, Germany flow cytometer
Ly6G-APC-Cy7  BD, Heidelberg, Germany 560600
Lysing solution  BD, Heidelberg, Germany 349202
Maxima SYBR Green  Thermo Scientific, Schwerte, Germany K0221 fluorescent DNA binding dye 
RNeasy Mini Kit  Qiagen, Hilden, Germany 74104 RNA extraction kit
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McFarland, H. F., Martin, R. Multiple sclerosis: a complicated picture of autoimmunity. Nat Immunol. 8, 913-919 (2007).
  2. Proudfoot, A. E. Chemokine receptors: multifaceted therapeutic targets. Nat Rev Immunol. 2, 106-115 (2002).
  3. Mihara, M., Hashizume, M., Yoshida, H., Suzuki, M., Shiina, M. IL-6/IL-6 receptor system and its role in physiological and pathological conditions. Clin Sci (Lond). 122, 143-159 (2012).
  4. Strydom, N., Rankin, S. M. Regulation of circulating neutrophil numbers under homeostasis and in disease. J Innate Immun. 5, 304-314 (2013).
  5. Kerstetter, A. E., Padovani-Claudio, D. A., Bai, L., Miller, R. H. Inhibition of CXCR2 signaling promotes recovery in models of multiple sclerosis. Exp Neurol. 220, 44-56 (2009).
  6. Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13, 159-175 (2013).
  7. Fan, X., et al. Murine CXCR1 is a functional receptor for GCP-2/CXCL6 and interleukin-8/CXCL8. J Biol Chem. 282, 11658-11666 (2007).
  8. Hartl, D., et al. Infiltrated neutrophils acquire novel chemokine receptor expression and chemokine responsiveness in chronic inflammatory lung diseases. J Immunol. 181, 8053-8067 (2008).
  9. Barcelos, L. S., et al. Role of the chemokines CCL3/MIP-1 alpha and CCL5/RANTES in sponge-induced inflammatory angiogenesis in mice. Microvasc Res. 78, 148-154 (2009).
  10. Wojkowska, D. W., Szpakowski, P., Ksiazek-Winiarek, D., Leszczynski, M., Glabinski, A. Interactions between neutrophils, Th17 cells, and chemokines during the initiation of experimental model of multiple sclerosis. Mediators Inflamm. , 590409 (2014).
  11. Bose, S., Cho, J. Role of chemokine CCL2 and its receptor CCR2 in neurodegenerative diseases. Arch Pharm Res. 36, 1039-1050 (2013).
  12. Mony, J. T., Khorooshi, R., Owens, T. Chemokine receptor expression by inflammatory T cells in EAE. Front Cell Neurosci. 8, 187 (2014).
  13. Katschke, K. J., et al. Differential expression of chemokine receptors on peripheral blood, synovial fluid, and synovial tissue monocytes/macrophages in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 44, 1022-1032 (2001).
  14. Trebst, C., et al. CCR1+/CCR5+ mononuclear phagocytes accumulate in the central nervous system of patients with multiple sclerosis. Am J Pathol. 159, 1701-1710 (2001).
  15. Karin, N., Wildbaum, G. The role of chemokines in adjusting the balance between CD4+ effector T cell subsets and FOXp3-negative regulatory T cells. Int Immunopharmacol. , (2015).
  16. Rottman, J. B., et al. Leukocyte recruitment during onset of experimental allergic encephalomyelitis is CCR1 dependent. Eur J Immunol. 30, 2372-2377 (2000).
  17. Izikson, L., Klein, R. S., Charo, I. F., Weiner, H. L., Luster, A. D. Resistance to experimental autoimmune encephalomyelitis in mice lacking the CC chemokine receptor (CCR)2. J Exp Med. 192, 1075-1080 (2000).
  18. Kuwabara, T., et al. CCR7 ligands are required for development of experimental autoimmune encephalomyelitis through generating IL-23-dependent Th17 cells. J Immunol. 183, 2513-2521 (2009).
  19. Liu, L., et al. Myelin repair is accelerated by inactivating CXCR2 on nonhematopoietic cells. J Neurosci. 30, 9074-9083 (2010).
  20. Matsui, M., et al. Treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis with the chemokine receptor antagonist Met-RANTES. J Neuroimmunol. 128, 16-22 (2002).
  21. Liu, L., et al. Severe disease, unaltered leukocyte migration, and reduced IFN-gamma production in CXCR3-/- mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol. 176, 4399-4409 (2006).
  22. Lee, M., Suk, K., Kang, Y., McGeer, E., McGeer, P. L. Neurotoxic factors released by stimulated human monocytes and THP-1 cells. Brain Res. 1400, 99-111 (2011).
  23. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. , (2012).
  24. O’Connor, R. A., et al. Adjuvant immunotherapy of experimental autoimmune encephalomyelitis: immature myeloid cells expressing CXCL10 and CXCL16 attract CXCR3+CXCR6+ and myelin-specific T cells to the draining lymph nodes rather than the central nervous system. J Immunol. 188, 2093-2101 (2012).
  25. Olesch, C., et al. MPGES-1-derived PGE2 suppresses CD80 expression on tumor-associated phagocytes to inhibit anti-tumor immune responses in breast cancer. Oncotarget. 6, 10284-10296 (2015).
  26. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 162, 156-159 (1987).
  27. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25, 402-408 (2001).
  28. Barthelmes, J., et al. Lack of ceramide synthase 2 suppresses the development of experimental autoimmune encephalomyelitis by impairing the migratory capacity of neutrophils. Brain Behav Immun. 46, 280-292 (2015).
  29. Schiffmann, S., et al. Ceramide synthase 6 plays a critical role in the development of experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol. 188, 5723-5733 (2012).
  30. Schiffmann, S., et al. PGE2/EP4 signaling in peripheral immune cells promotes development of experimental autoimmune encephalomyelitis. Biochem Pharmacol. 87, 625-635 (2014).
  31. Giglio, S., Monis, P. T., Saint, C. P. Demonstration of preferential binding of SYBR Green I to specific DNA fragments in real-time multiplex PCR. Nucleic Acids Res. 31, e136 (2003).
  32. Vesterinen, H. M., et al. Improving the translational hit of experimental treatments in multiple sclerosis. Mult Scler. 16, 1044-1055 (2010).
  33. ‘t Hart, B. A., Gran, B., Weissert, R. EAE: imperfect but useful models of multiple sclerosis. Trends Mol Med. 17, 119-125 (2011).
  34. Serada, S., et al. IL-6 blockade inhibits the induction of myelin antigen-specific Th17 cells and Th1 cells in experimental autoimmune encephalomyelitis. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 9041-9046 (2008).
  35. Berer, K., et al. Commensal microbiota and myelin autoantigen cooperate to trigger autoimmune demyelination. Nature. 479, 538-541 (2011).
  36. Shetty, A., et al. Immunodominant T-cell epitopes of MOG reside in its transmembrane and cytoplasmic domains in EAE. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 1, 22-22 (2014).
  37. Schmitz, K., et al. R-flurbiprofen attenuates experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. EMBO Mol Med. 6, 1398-1422 (2014).
  38. Procaccini, C., De Rosa, V., Pucino, V., Formisano, L., Matarese, G. Animal models of Multiple Sclerosis. Eur J Pharmacol. 759, 182-191 (2015).
  39. Pollinger, B., et al. Spontaneous relapsing-remitting EAE in the SJL/J mouse: MOG-reactive transgenic T cells recruit endogenous MOG-specific B cells. J Exp Med. 206, 1303-1316 (2009).
  40. Rodriguez, M., Oleszak, E., Leibowitz, J. Theiler’s murine encephalomyelitis: a model of demyelination and persistence of virus. Crit Rev Immunol. 7, 325-365 (1987).
  41. Lipton, H. L. Theiler’s virus infection in mice: an unusual biphasic disease process leading to demyelination. Infect Immun. 11, 1147-1155 (1975).
  42. Matsushima, G. K., Morell, P. The neurotoxicant, cuprizone, as a model to study demyelination and remyelination in the central nervous system. Brain Pathol. 11, 107-116 (2001).
  43. El-behi, M., Rostami, A., Ciric, B. Current views on the roles of Th1 and Th17 cells in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroimmune Pharmacol. 5, 189-197 (2010).
  44. Mann, M. K., Ray, A., Basu, S., Karp, C. L., Dittel, B. N. Pathogenic and regulatory roles for B cells in experimental autoimmune encephalomyelitis. Autoimmunity. 45, 388-399 (2012).
  45. Lassmann, H., Bruck, W., Lucchinetti, C. F. The immunopathology of multiple sclerosis: an overview. Brain Pathol. 17, 210-218 (2007).
  46. Simmons, S. B., Pierson, E. R., Lee, S. Y., Goverman, J. M. Modeling the heterogeneity of multiple sclerosis in animals. Trends Immunol. 34, 410-422 (2013).
  47. Praet, J., Guglielmetti, C., Berneman, Z., Vander Linden, A., Ponsaerts, P. Cellular and molecular neuropathology of the cuprizone mouse model: clinical relevance for multiple sclerosis. Neurosci Biobehav Rev. 47, 485-505 (2014).

Tags

Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE)Multiple SclerosisDemyelinationImmune Cell InfiltrationMiceMyelin Oligodendrocyte GlycoproteinComplete Freund’s AdjuvantPertussis ToxinLymph NodeSpinal CordClinical Symptoms

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Barthelmes, J., Tafferner, N., Kurz, J., de Bruin, N., Parnham, M. J., Geisslinger, G., Schiffmann, S. Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues. J. Vis. Exp. (111), e53933, doi:10.3791/53933 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image