Mouse ultrasonic vocalizations are used as proxies to model the genetic bases of vocal communication deficits in mouse models for neuropsychiatric disorders. The present protocol describes three experimental contexts that reliably elicit ultrasonic vocalizations from pups (throughout development) and adult mice (same-sex interactions, male-estrus female interactions).
Mice emit ultrasonic vocalizations in different contexts throughout development and in adulthood. These vocal signals are now currently used as proxies for modeling the genetic bases of vocal communication deficits. Characterizing the vocal behavior of mouse models carrying mutations in genes associated with neuropsychiatric disorders such as autism spectrum disorders will help to understand the mechanisms leading to social communication deficits. We provide here protocols to reliably elicit ultrasonic vocalizations in pups and in adult mice. This standardization will help reduce inter-study variability due to the experimental settings. Pup isolation calls are recorded throughout development from individual pups isolated from dam and littermates. In adulthood, vocalizations are recorded during same-sex interactions (without a sexual component) by exposing socially motivated males or females to an unknown same-sex conspecific. We also provide a protocol to record vocalizations from adult males exposed to an estrus female. In this context, there is a sexual component in the interaction. These protocols are established to elicit a large amount of ultrasonic vocalizations in laboratory mice. However, we point out the important inter-individual variability in the vocal behavior of mice, which should be taken into account by recording a minimal number of individuals (at least 12 in each condition). These recordings of ultrasonic vocalizations are used to evaluate the call rate, the vocal repertoire and the acoustic structure of the calls. Data are combined with the analysis of synchronous video recordings to provide a more complete view on social communication in mice. These protocols are used to characterize the vocal communication deficits in mice lacking ProSAP1/Shank2, a gene associated with autism spectrum disorders. More ultrasonic vocalizations recordings can also be found on the mouseTube database, developed to favor the exchange of such data.
У пациентов с нервно – психических расстройств обычно отображают дефицита в социальной коммуникации (например, пациенты с расстройствами аутистического спектра, шизофрении или болезни Альцгеймера) 1. Генно – инженерные мыши все чаще и чаще используются для моделирования генетических причин этих расстройств 2. Изучение социальной коммуникации в этих мышиных моделях представляет большой интерес для понимания механизмов генетических мутаций, приводящих к атипичным социальных дисфункций и для тестирования новых методов лечения. Поскольку мыши являются социальными животными и общаться друг с другими, используя обонятельные, тактильные, визуальные и акустические сигналы, они являются подходящими моделями для оценки социальной коммуникации.
Mouse ультразвуковые вокализации в настоящее время в настоящее время используется в качестве прокси – сервера для моделирования генетических основ вокальной дефицитов связи 3,4 (но существование вокального обучения у этого вида все еще обсуждается 5,6, даже если большинство недавних исследований arguе за отсутствие вокального обучения 7). Лабораторных мышей были обнаружены испускать ультразвуковые вокализации в мать-ребенок отношений, в между мужчинами и женщинами социально-сексуального взаимодействия, однополые социальных взаимодействий (обзор в ссылке 8) , а также в отношении несовершеннолетних, в отношении несовершеннолетних социальных взаимодействий 9. Щенками мыши испускают вызовы изоляции в течение первых двух недель жизни , когда изолированы от плотины и однопометные 10. Самцы испускают ультразвуковые вокализации , когда в присутствии течки самки (или мочеполовых киев от нее) 11,12. Самцы и самки испускают ультразвуковые вокализации при взаимодействии с неизвестным конспецифичный того же пола 13,14. Организация и функции этих вокализации не вполне ясны и требуют дальнейшего изучения. Современные знания о функциональном аспекте ограничена из-поисковых процессе индукции поведения у матерей слуха изоляции щенком вызовов, облегчение близости взрослых самок по отношению к взрослых мужчин vocalizatИоны 15 и повышенная исследовательское поведение взрослых самцов слуха взрослых самок вокализации 16.
Характеризуя отклонения в вокальной коммуникации в мышиных моделях психоневрологических расстройств, должны проводиться в стандартных условиях, чтобы исключить значительный вклад экспериментальных условий. Такие характеризации, в сочетании с оценкой одновременных социальных взаимодействий и нейробиологических исследований, в различных генетических моделей должны улучшить наши знания о генетическом вкладе в различные аспекты мыши ультразвуковой связи. В течение длительного срока, он должен дать дополнительный свет на некоторых нейробиологических основах социальной коммуникации в организме человека. В настоящее время мы нацелены на предоставление простых протоколов, чтобы надежно выявить ультразвуковые вокализации в процессе развития и в зрелом возрасте как для самцов и самок мышей в лабораторных условиях. Такие протоколы должны облегчить стандартизацию записей более надежно сравнить UltrAsonic выбросы вокализация между штаммами и лабораторий. Это также должно способствовать создание таких записей в лабораториях, не имеющих опыта работы с мышью ультразвуковых вокализации записей. Мы также выделить текущую возможность объединить ультразвуковые данные вокализации с подробными поведенческими данными, собранными одновременно во время социальных взаимодействий у взрослых мышей, чтобы получить важную информацию о социальных нарушений, а также о контексте эмиссии ультразвуковых вокализации. Такой анализ позволит пролить новый свет на организацию и функции мыши ультразвуковых вокализации. Наконец, мы также рекламировать возможность обмениваться записями ультразвуковых вокализации со всем научным сообществом на базе mouseTube (http://mousetube.pasteur.fr). Открытый доступ к записи данных аудио должны повысить знания о мыши ультразвуковой связи, позволяя ученым сравнить свои собственные данные с ультразвуковыми вокализации, записанные в других Laboratories (с одинаковыми или различными штаммами / протоколов), и / или оспаривать их методы анализа с файлами, записанными в различных условиях.
Протокол, представленные здесь обеспечивает стандартизированные и надежные способы сбора мыши ультразвуковой вокализации в лаборатории. Эти очень стесненные ситуации представляют преимущество стандартизации. Они с успехом используются для сравнения штаммов или генотипов в пределах штаммов 18,19,26,27. Как представлено в представительных результатов, эти методы позволяют идентифицировать атипичной социальной коммуникации у мышей мутировали для Shank2, ген , связанный с расстройствами аутистического спектра. Сравнения между штаммами мыши, между различными контекстами или даже между лабораториями будет вызвана наличием больших массивов данных в базе данных mouseTube. Этот инструмент должен стимулировать исследования на мышах ультразвуковых вокализации, позволяя многофакторного анализа.
Описанные здесь протоколы оптимизированы для тестирования мышей разных генотипов в пределах штамма, как это делается в большинстве исследований моделирования генетической Contribution психоневрологических расстройств. Рекомендуется экспериментально разработать каждое исследование, чтобы иметь лучшие средства управления возможно. Действительно, эффекты помет может замаскировать или искусственно раздувать генетические эффекты 28,29. Поэтому целесообразно включать элементы управления однопометница для каждого генотипа. Поэтому размножения гетерозиготные родители должны отдавать предпочтение, так как это позволит правильно сопрягать мутантных и контрольных мышей в пределах помета. Это оправдывает лапу татуировку маркировки всех мышат (ослепленный генотипу) для отслеживания людей во время записи каждые два дня. Генотипирование делается при отъеме, взяв образцы хвоста. При записи вызовов изоляции щенком от P2, мы не рекомендуем брать образцы хвоста уже в щенками, так как эта операция включает в себя дополнительные манипуляции и стресс очень близко во времени сеанса записи.
Протоколы предлагаемых здесь, чтобы вызывать ультразвуковые вокализации у взрослых не позволяет четко идентифицировать ИРРолучатель из вокализации. Это объясняет, почему мы манипулируем мотивацию испытуемого животного. В самом деле, тест мыши изолированы и не новый пришелец и подопытных животных приучить в течение длительного времени на тест клетки во время одного пола взаимодействий. В между мужчинами и женщинами взаимодействий, введенная самка не изолирована и тест мужчины приучает за более короткое время, так как мотивация может быть выше в этом сексуальном контексте. Эти манипуляции мотивации должны максимизировать вероятность испытательной мыши, излучающего вокализации и не представил один. Для записи мужских ультразвуковых вокализации в сексуальном контексте, простой ватный тампон со свежим (т.е. не замороженного) мочи с течки самки также могут быть введены в клетке 30. Этот метод позволяет назначение ультразвуковых вокализации в тест-мужчина с 100% уверенностью, но это не позволяет собирать какой-либо конкретной информации о фактическом социальном контексте эмиссии этих вокализации. Поэтому мы выступаем за Protocoл описано здесь (со свободно движущейся течки самки). Мы также рекомендуем всегда использовать введенную мышей из того же штамма при испытании мышей из мутантного штамма и анализировать данные в виде пары мышей вокализации. Одно недавнее исследование способствует использованию триангуляции локализовать излучатель 31. В этом исследовании были обнаружены самки также испускают ультразвуковые вокализации во время встречи с мужчиной. Это можно объяснить тем фактом, что они были изолированы в течение, по крайней мере две недели до начала сеанса записи. Обобщение использования триангуляции предложенного в данном исследовании, следует тем не менее, позволяет идентифицировать эмиттером вокализации в большинстве случаев, если видеозаписи надлежащим образом синхронизированы.
Изолирующие звонки от мышат, записанных во время развития не нарушается фоновый шум от постельных принадлежностей. Обычно автоматический анализ работает очень хорошо, чтобы извлечь основные переменные. В противоположность этому, вокализации, записанные от взрослых гisturbed фоновым шумом от животных, движущихся в постельных принадлежностей. Автоматический анализ может потерпеть неудачу, и поэтому ручной анализ следует использовать. Тем не менее, добавив постельные принадлежности в испытательной клетке должны обеспечить условия, которые являются менее стрессовым для животных, чем голой почвы (что мыши не любят). Дальнейшие усилия в сообществе сосредоточены на совершенствовании автоматического обнаружения ультразвуковых вокализации в различных условиях, даже те, подразумевающих фоновые шумы. Например, программное обеспечение VOICE позволяет анализировать вокализации , которые были выбраны вручную для отсутствие фонового шума 32. В этом программном обеспечении, извлечение акустических переменных происходит автоматически, но нуждается в начальный выбор вручную.
Следует отметить, что между индивидуальной изменчивости очень важна в вокальной поведении мышей. Например, частота вызовов взрослых самцов в присутствии течки самки очень распространен (рисунок 1). Мы суggest эти стандартизированные протоколы для выявления ультразвуковых вокализации уже ограничивает изменчивость, связанную с экспериментального контекста. Тем не менее, мы хотели бы отметить важность представления не только среднее значение и SEM для данных, но самое главное , отдельные точки в образцах малого размера 33. Кроме того, весьма актуальна – если нет необходимости – для записи по меньшей мере 12 особей в каждой группе / генотипа собрать репрезентативные данные. Во многих случаях межиндивидуальную изменчивость не должна быть скрытой (как правило, это не может быть), и это может иметь большое значение для выявления лиц, несущих генетическую мутацию изученный, но не отображающие никакого атипичного фенотипа. Такие лица могут содержать сведения о компенсации, которые могли бы открыть новые пути для лечения генетических заболеваний.
В большинстве поведенческих характеристик моделей мыши для психоневрологических расстройств, вокального поведения и социальные контакты являются рассмотретьред друг от друга (например, 19,27,34,35). Последние методы анализа в настоящее время обеспечивают полуавтоматическую подробную характеристику социальных событий и последовательностей событий во время взаимодействия ( с использованием MiceProfiler, например) 36, а также возможность объединить этот анализ с данными из аудиозаписей. Основным преимуществом этого метода является то, чтобы обеспечить полное представление о социальной коммуникации в мышиных моделях ASD, чтобы более точно определить, какие аспекты социальной коммуникации затронуты. В настоящем протоколе синхронизация по-прежнему ручной, но это может быть улучшено путем активации записи видео с помощью программного обеспечения записи звука. Этот тип анализа должен стать стандартом, чтобы обеспечить более полное представление о дефицита социальной коммуникации в мышиных моделях нервно-психических расстройств. Кроме того, до сих пор, голосовые сигналы , которые в основном анализируются со стороны эмиттера (т.е. тесты построены в пользу выбросов VOческие сигналы по тестируемой мыши, как в настоящих протоколов). Основное внимание следует также теперь быть установлен на приемнике этих сигналов, чтобы лучше определить функции этих акустических сигналов. Это должно быть сделано путем оценки и поведение Неё мышей в настоящих протоколов у взрослых ( с использованием MiceProfiler, например) 36, с помощью экспериментов воспроизведения 16, или путем создания новых протоколов. В самом деле, настоящие протоколы обеспечивают очень стесненных ситуации, которые могут не отражать точные этологическим условия эмиссии вокализации у мышей. Спонтанное излучение ультразвуковых вокализации должны быть лучше характеризуется использованием непрерывных аудио- и видеозаписи, чтобы пролить больше света на спонтанную вокального поведения мышей.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Fondation de France; by the ANR FLEXNEURIM [ANR09BLAN034003]; by the ANR [ANR- 08-MNPS-037-01-SynGen]; by Neuron-ERANET (EUHF-AUTISM); by the Fondation Orange; by the Fondation FondaMentale; by the Fondation de France; by the Fondation Bettencourt-Schueller. The research leading to this article has also received support from the Innovative Medicine Initiative Joint Undertaking under grant agreement no. 115300, resources of which are composed of financial contribution from the European Union’s Seventh Framework Program (FP7/2007-2013) and EFPIA companies’ in kind contribution. We thank Julie Lévi-Strauss for helpful comments on the manuscript and six anonymous reviewers whose comments noticeably improved the manuscript.
needles 0.3 x 13 mm [30G 1/2"] | BD Microlance | 304000 | – |
green tattoo paste | Ketchum Manufacturing Inc., Ottawa, Canada | 329AA | – |
thermometer | Fisherbrand, Waltham, USA | 4126 (W255NA) | – |
self-made soundproof chamber (pups) | Institut Pasteur, Paris | – | acoustic foam + plexiglas; inside dimensions (W x H x D): 32 x 33 x 32 cm |
small surface thermister + single probe thermocouple | Harvard Apparatus | 599814 + 601956 | – |
smell-less pen | for instance: Giotto | – | ink made with water, washable: these pens are designed for babies |
Ethanol absolute (100%) | Sigma Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, France | 24103 | diluted 1/10 |
Condenser ultrasound microphone Avisoft-Bioacoustics CM16/CMPA | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #40011 | furnished with extension cables by the Avisoft company |
Ultrasound Gate 416H | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #34163 | sound card |
Avisoft Recorder USGH | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #10301; #10302 | recording software for Windows Vista, 7 and 8 |
Avisoft SASLab Pro | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #10101, 10111; #10102, 10112; | Windows 10, 8.1, 8, 7 or Vista including Intel-based Apple Macintosh running Boot Camp, Parallels or similar virtualization software. |
Laptop or Apple Macintosh running Boot Camp | – | – | running Windows 10, 8.1, 8, 7 or Vista; for the Apple Macintosh, Boot Camp is preferred to virtualizations softwares such as Parallels due to memory constraints |
plastic recipient (pup recordings) | Lock & Lock, Chatswood, USA | HPL932D | Lock & Lock Stackable Airtight Container Round 700ml; use without the cover; dimensions: 9 cm diameter, 10 cm height |
PBS 1X (pH=7.4) | Gibco (Life Technologies) | 10010-023 | – |
slides | Menzel-Gläser, Thermo Scientific | J1800AMNZ | Superfrost Plus |
May-Grünwald solution 500 ml | RAL Réactifs, Martillac, France | 320070-0500 | – |
Giemsa R 500 ml | RAL Réactifs, Martillac, France | 720-1107 | diluted 1/20 in phosphate buffer solution |
phosphate buffer solution (self-made) | – | – | pH=7, 0.1 M: 39 ml NaH2PO4 0.2 M + 61 ml Na2HPO4 0.2 M + 100 ml H2O (final volume: 200 ml) |
test cage | Institut Pasteur, Paris | – | 50 x 25 cm, 30 cm height; Plexiglas |
self-made soundproof chamber (adult recordings) | Institut Pasteur, Paris | – | acoustic foam + PVC; inside dimensions (W x H x D): 66 x 90 x 46 cm |
video camera | From Noldus Information Technologies, Wageningen, The Netherlands | – | high-resolution CamTech Super-Hi-Res video camera; 25 fps |
EthoVision XT | Noldus Information Technology, Wageningen, The Netherlands | http://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/ethovision-xt | video acquisition software |
Mice Profiler Tracker plugin from the ICY platform | Bio Image Analysis, Institut Pasteur, Paris | http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Mice_Profiler_Tracker | tracking software to analyse behavioral events during social interactions |