Gravação mouse ultra-som vocalizações para avaliar Comunicação Social
Summary
Mouse ultrasonic vocalizations are used as proxies to model the genetic bases of vocal communication deficits in mouse models for neuropsychiatric disorders. The present protocol describes three experimental contexts that reliably elicit ultrasonic vocalizations from pups (throughout development) and adult mice (same-sex interactions, male-estrus female interactions).
Abstract
Mice emit ultrasonic vocalizations in different contexts throughout development and in adulthood. These vocal signals are now currently used as proxies for modeling the genetic bases of vocal communication deficits. Characterizing the vocal behavior of mouse models carrying mutations in genes associated with neuropsychiatric disorders such as autism spectrum disorders will help to understand the mechanisms leading to social communication deficits. We provide here protocols to reliably elicit ultrasonic vocalizations in pups and in adult mice. This standardization will help reduce inter-study variability due to the experimental settings. Pup isolation calls are recorded throughout development from individual pups isolated from dam and littermates. In adulthood, vocalizations are recorded during same-sex interactions (without a sexual component) by exposing socially motivated males or females to an unknown same-sex conspecific. We also provide a protocol to record vocalizations from adult males exposed to an estrus female. In this context, there is a sexual component in the interaction. These protocols are established to elicit a large amount of ultrasonic vocalizations in laboratory mice. However, we point out the important inter-individual variability in the vocal behavior of mice, which should be taken into account by recording a minimal number of individuals (at least 12 in each condition). These recordings of ultrasonic vocalizations are used to evaluate the call rate, the vocal repertoire and the acoustic structure of the calls. Data are combined with the analysis of synchronous video recordings to provide a more complete view on social communication in mice. These protocols are used to characterize the vocal communication deficits in mice lacking ProSAP1/Shank2, a gene associated with autism spectrum disorders. More ultrasonic vocalizations recordings can also be found on the mouseTube database, developed to favor the exchange of such data.
Introduction
Pacientes com distúrbios neuropsiquiátricos geralmente exibem déficits na comunicação social (por exemplo, pacientes com distúrbios do espectro do autismo, esquizofrenia ou doença de Alzheimer) 1. Engenharia genética camundongos são mais e mais freqüentemente usado para modelar causas genéticas desses distúrbios 2. Estudar a comunicação social desses modelos do rato é de grande interesse para a compreensão dos mecanismos de mutações genéticas que conduzem a disfunções sociais atípicos e para testar novas terapias. Desde os ratos são animais sociais e se comunicar uns com os outros usando olfativa, tátil, sinais acústicos e visuais, eles são modelos adequados para avaliar a comunicação social.
Rato vocalizações ultra-sônicas são agora usado atualmente como um proxy para modelar as bases genéticas de déficits de comunicação vocais 3,4 (mas a existência de aprendizado vocal nesta espécie ainda é debatido 5,6, mesmo que a maioria dos estudos recentes argue pela ausência de aprendizagem vocal 7). Ratos de laboratório foram encontrados para emitir vocalizações ultra-sônicas nas relações mãe-filho, em interações sócio-sexual entre homem e mulher, em interações sociais do mesmo sexo (revisto em referência 8) e nas interações sociais juvenis-juvenil 9. Filhotes de rato emitem chamadas de isolamento durante as primeiras duas semanas de vida, quando isolada a partir da barragem e irmãos 10. Os machos emitem vocalizações ultra-sônicas quando em presença de uma fêmea estro (ou pistas urinário dela) 11,12. Os machos e as fêmeas emitem vocalização ultra-sónica, ao interagir com uma mesma espécie desconhecida do mesmo sexo 13,14. A organização e as funções destas vocalizações não são completamente claros e necessitam de mais investigações. O conhecimento atual sobre o aspecto funcional é limitada ao levantamento do comportamento de recuperação em mães de ouvir chamadas de isolamento cachorro, a facilitação da proximidade de fêmeas adultas em direção vocalizat macho adultoiões 15 e o aumento do comportamento exploratório dos homens adultos auditivos adultos vocalizações femininas 16.
Caracterizar as anomalias na comunicação vocal em modelos de ratos com distúrbios neuropsiquiátricos deve ser realizado em condições padronizadas para descartar grande contribuição das condições experimentais. Tais caracterizações, combinados com a avaliação das interações sociais simultâneas e estudos neurobiológicos, em vários modelos genéticos deve melhorar o nosso conhecimento sobre a contribuição genética para os diferentes aspectos do rato de comunicação ultra-sônica. Durante um longo prazo, deve dar mais luz sobre algumas bases neurobiológicas de comunicação social em humanos. Nós atualmente visam fornecer protocolos simples para extrair de forma confiável vocalizações ultra-som durante o desenvolvimento e na idade adulta para ambos os ratos macho e fêmea no laboratório. Tais protocolos devem facilitar a padronização de gravações para comparar de forma mais confiável ultremissões de vocalização Asonic entre as linhagens e laboratórios. Ele também deve facilitar a criação de tais gravações em laboratórios que têm nenhuma experiência prévia com rato vocalizações ultra-sônicas gravações. Destacamos também a actual possibilidade de combinar dados vocalizações ultra-sônicas com dados comportamentais detalhados recolhidos simultaneamente durante interações sociais em ratos adultos, para obter informações cruciais sobre prejuízos sociais, bem como no contexto da emissão de vocalizações ultra-sônicas. Tais análises irá lançar uma nova luz sobre a organização e as funções do rato vocalizações ultra-sônicas. Finalmente, nós também anunciar a possibilidade de compartilhar gravações de vocalizações ultra-som com toda a comunidade científica sobre o banco de dados mouseTube (http://mousetube.pasteur.fr). livre acesso a dados de gravação de áudio deve impulsionar o conhecimento do rato de comunicação ultra-som, permitindo que os cientistas para comparar os seus próprios dados com vocalizações de ultra-sons registrados em outros labolabora- (com estirpes / protocolos semelhantes ou diferentes), e / ou para desafiar os seus métodos de análise com arquivos gravados em diferentes condições.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo aqui apresentado fornece formas padronizadas e confiáveis para recolher rato vocalizações ultra-sônicas no laboratório. Estas situações restritas muito apresentar a vantagem de normalização. Eles são usados com sucesso para comparar estirpes ou genótipos dentro estirpes 18,19,26,27. Conforme apresentado nos resultados representativos, esses métodos permitem a identificação de Comunicação Social atípico em camundongos mutantes para Shank2, um gene associado a perturbações do espectro do autismo. As comparações entre linhagens de camundongos, entre diferentes contextos ou mesmo entre laboratórios será acionado pela disponibilidade de conjuntos de dados maiores na base de dados mouseTube. Esta ferramenta deve impulsionar os estudos sobre rato vocalizações ultra-sônicas, permitindo análises multivariadas.
Os protocolos aqui descritos são optimizados para testar ratinhos de diferentes genótipos dentro de uma estirpe, como é feito na maior parte dos estudos de modelação a C genéticaONTRIBUIÇÃO a distúrbios neuropsiquiátricos. Recomenda-se a projetar experimentalmente cada estudo para ter os melhores controles possíveis. Na verdade, os efeitos da maca pode mascarar ou inflar artificialmente os efeitos genéticos 28,29. Por isso, é aconselhável incluir controles da mesma ninhada de cada genótipo. Breeding pais heterozigotos deve, portanto, ser favorecida, uma vez que permitirá a correspondência correta de ratos mutantes e controle dentro de uma ninhada. Isto justifica a marcação de todos os filhotes tatuagem da pata (cego para o genótipo) para rastrear indivíduos ao longo das gravações a cada dois dias. A genotipagem é feito ao desmame, tomando amostras de cauda. Ao gravar chamadas de isolamento filhote de P2, nós não recomendaria a recolha de amostras de cauda já nos filhotes, uma vez que esta operação inclui a manipulação suplementar e estresse muito perto no tempo para uma sessão de gravação.
Os protocolos sugeridos aqui para obter vocalizações ultra-sônicas em adultos não permite uma identificação clara do emitter das vocalizações. Isso explica por que manipular a motivação do animal de teste. Na verdade, os ratinhos de teste são isoladas e não o recém-chegado e os animais de teste se habituem durante um longo período de tempo para a gaiola de teste durante interacções do mesmo sexo. Em interacções macho-fêmea, a fêmea introduzido não é isolado e o macho de teste habitua de tempo mais curto, uma vez motivação pode ser mais elevado neste contexto sexual. Estas manipulações de motivação deve maximizar a probabilidade de o rato teste de emissão de vocalizações e não o apresentou. Para gravar vocalizações ultra-sónicas macho num contexto sexual, um cotonete simples com urina (ou seja, não congelada) fresco de uma fêmea estro também pode ser introduzido na gaiola 30. Este método permite a atribuição de vocalizações ultra-sônicas para o macho teste com 100% de certeza, mas impede a coleta qualquer informação específica sobre o contexto social real da emissão destas vocalizações. Portanto, somos a favor da Protocol descrito aqui (com uma fêmea estro livremente em movimento). Recomendamos também usar sempre ratos introduzido a partir da mesma estirpe ao testar os ratos a partir de uma estirpe mutante e analisar os dados como um par de ratos vocalizando. Um estudo recente promove o uso da triangulação para localizar o emissor 31. Neste estudo, as fêmeas foram encontrados para também emitem vocalizações ultra-sónicas durante encontros com um macho. Isto pode ser explicado pelo fato de que foram isolados por pelo menos duas semanas antes da sessão de gravação. A generalização do uso da triangulação proposto neste estudo devem, no entanto, permitir a identificação do emissor das vocalizações na maioria dos casos, se as gravações de vídeo são devidamente sincronizados.
As chamadas de isolamento de filhotes registrados durante o desenvolvimento não sejam perturbados pelo ruído de fundo da cama. Normalmente uma análise automática funciona muito bem para extrair os principais variáveis. Em contraste, as vocalizações gravadas de adultos são disturbed pelo ruído de fundo dos animais que se deslocam na cama. A análise automática pode falhar, e por conseguinte a análise manual deve ser usado. No entanto, a adição de cama na gaiola de ensaio deve proporcionar condições que são menos estressante para os animais do que o solo descoberto (que os ratos não gostam). Mais esforços da comunidade estão concentrados em melhorar a detecção automática de vocalizações ultra-sônicas sob várias condições, mesmo aqueles que impliquem os ruídos de fundo. Por exemplo, o software de voz permite analisar vocalizações que tinham sido seleccionadas manualmente para a ausência de ruído de fundo 32. Neste software, a extração das variáveis acústicas é automática, mas necessita da selecção manual inicial.
Deve notar-se que a variabilidade inter-individual é muito importante no comportamento vocal de ratinhos. Por exemplo, a taxa de chamada de machos adultos em presença de uma fêmea estro é muito distribuído (Figura 1). Nós suggest desses protocolos padronizados para eliciar vocalizações ultra-sónicas já para limitar a variabilidade relacionada com o contexto experimental. No entanto, gostaríamos de salientar a importância de apresentar não apenas a média e SEM para os dados, mas o mais importante os pontos individuais em amostras de pequeno tamanho 33. Ele também é muito relevante – se não for necessário – para gravar pelo menos 12 indivíduos de cada grupo / genótipo para recolher dados representativos. Em muitos casos, a variabilidade inter-individual não deve ser escondido (normalmente ele não pode ser), e pode ser de grande importância para identificar os indivíduos portadores da mutação genética estudada, mas não exibem qualquer fenótipo atípico. Tais indivíduos poderiam fornecer pistas sobre compensações, o que pode abrir novos caminhos para terapias de doenças genéticas.
Na maioria das caracterizações de comportamento de modelos de rato para distúrbios neuropsiquiátricos, comportamento vocal e contatos sociais são considereEd para além (por exemplo, 19,27,34,35). Recentemente, métodos de análise agora fornecer uma caracterização detalhada semi-automática dos eventos sociais e sequências de eventos durante uma interacção (por exemplo, usando MiceProfiler) 36, bem como a possibilidade de combinar este com a análise de dados a partir de gravações de áudio. A principal vantagem deste método é fornecer uma visão abrangente da comunicação social nos modelos do rato do ASD, para identificar mais precisamente quais os aspectos de comunicação social são afetados. No presente protocolo é a sincronização ainda manual, mas isto pode ser melhorado pelo desencadeamento da gravação de vídeo através do software de gravação de áudio. Este tipo de análise deve se tornar o padrão para fornecer uma visão mais abrangente de déficits de comunicação social no mouse modelos de distúrbios neuropsiquiátricos. Além disso, até agora, os sinais vocais são principalmente analisadas a partir do lado do emissor (isto é, os testes são construídos para favorecer a emissão de VOsinais de cal por o rato testados, como no presente protocolos). O foco agora deve também ser definida no receptor desses sinais, para melhor identificar as funções desses sinais acústicos. Isto deve ser feito avaliando também o comportamento dos camundongos recém-chegado nos actuais protocolos em adultos (usando MiceProfiler por exemplo) 36, utilizando experimentos de reprodução 16, ou através da criação de novos protocolos. Na verdade, os actuais protocolos proporcionam situações muito restritas que talvez não reflitam as condições etológicas exatas de emissão de vocalização em camundongos. A emissão espontânea de vocalizações ultra-som terá de ser mais bem caracterizados usando gravações de áudio e vídeo contínuos para lançar mais luz sobre o comportamento vocal espontânea de camundongos.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Fondation de France; by the ANR FLEXNEURIM [ANR09BLAN034003]; by the ANR [ANR- 08-MNPS-037-01-SynGen]; by Neuron-ERANET (EUHF-AUTISM); by the Fondation Orange; by the Fondation FondaMentale; by the Fondation de France; by the Fondation Bettencourt-Schueller. The research leading to this article has also received support from the Innovative Medicine Initiative Joint Undertaking under grant agreement no. 115300, resources of which are composed of financial contribution from the European Union’s Seventh Framework Program (FP7/2007-2013) and EFPIA companies’ in kind contribution. We thank Julie Lévi-Strauss for helpful comments on the manuscript and six anonymous reviewers whose comments noticeably improved the manuscript.
Materials
| needles 0.3 x 13 mm [30G 1/2"] | BD Microlance | 304000 | – |
| green tattoo paste | Ketchum Manufacturing Inc., Ottawa, Canada | 329AA | – |
| thermometer | Fisherbrand, Waltham, USA | 4126 (W255NA) | – |
| self-made soundproof chamber (pups) | Institut Pasteur, Paris | – | acoustic foam + plexiglas; inside dimensions (W x H x D): 32 x 33 x 32 cm |
| small surface thermister + single probe thermocouple | Harvard Apparatus | 599814 + 601956 | – |
| smell-less pen | for instance: Giotto | – | ink made with water, washable: these pens are designed for babies |
| Ethanol absolute (100%) | Sigma Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, France | 24103 | diluted 1/10 |
| Condenser ultrasound microphone Avisoft-Bioacoustics CM16/CMPA | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #40011 | furnished with extension cables by the Avisoft company |
| Ultrasound Gate 416H | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #34163 | sound card |
| Avisoft Recorder USGH | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #10301; #10302 | recording software for Windows Vista, 7 and 8 |
| Avisoft SASLab Pro | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #10101, 10111; #10102, 10112; | Windows 10, 8.1, 8, 7 or Vista including Intel-based Apple Macintosh running Boot Camp, Parallels or similar virtualization software. |
| Laptop or Apple Macintosh running Boot Camp | – | – | running Windows 10, 8.1, 8, 7 or Vista; for the Apple Macintosh, Boot Camp is preferred to virtualizations softwares such as Parallels due to memory constraints |
| plastic recipient (pup recordings) | Lock & Lock, Chatswood, USA | HPL932D | Lock & Lock Stackable Airtight Container Round 700ml; use without the cover; dimensions: 9 cm diameter, 10 cm height |
| PBS 1X (pH=7.4) | Gibco (Life Technologies) | 10010-023 | – |
| slides | Menzel-Gläser, Thermo Scientific | J1800AMNZ | Superfrost Plus |
| May-Grünwald solution 500 ml | RAL Réactifs, Martillac, France | 320070-0500 | – |
| Giemsa R 500 ml | RAL Réactifs, Martillac, France | 720-1107 | diluted 1/20 in phosphate buffer solution |
| phosphate buffer solution (self-made) | – | – | pH=7, 0.1 M: 39 ml NaH2PO4 0.2 M + 61 ml Na2HPO4 0.2 M + 100 ml H2O (final volume: 200 ml) |
| test cage | Institut Pasteur, Paris | – | 50 x 25 cm, 30 cm height; Plexiglas |
| self-made soundproof chamber (adult recordings) | Institut Pasteur, Paris | – | acoustic foam + PVC; inside dimensions (W x H x D): 66 x 90 x 46 cm |
| video camera | From Noldus Information Technologies, Wageningen, The Netherlands | – | high-resolution CamTech Super-Hi-Res video camera; 25 fps |
| EthoVision XT | Noldus Information Technology, Wageningen, The Netherlands | http://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/ethovision-xt | video acquisition software |
| Mice Profiler Tracker plugin from the ICY platform | Bio Image Analysis, Institut Pasteur, Paris | http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Mice_Profiler_Tracker | tracking software to analyse behavioral events during social interactions |
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