ソーシャル・コミュニケーションを評価するためにマウスの超音波発声を記録

倫理の声明：動物を対象とする手順はパスツール研究所、パリでComitéドールEthiqueアン実験ANIMALE（CETEA）のn°89によって承認されています。 1.動物の準備子犬の分離通話を記録するには、関心のマウス系統から妊娠した雌を得ます。注：ロバスト制御動物を得るために、野生型、ヘテロ接合およびノックアウト仔を含む少なくとも10リットルを得るために、ヘテロ接合の雄と雌の繁殖。 同性間の相互作用の間に発声を記録するために、成体マウスの2種類を取得します。 （アカウントに個体間変動を取るために）関心の株からの試験マウスとして、少なくとも12人の男性または各遺伝子型の女性12名を取得します。注：このプロトコルは、大人のためによく適応しているが、それは実験9の前に減少し、分離時間で、少年に調整することができます。このテストでは、男性または女性のために動作します。ただし、テストの男性を避けますオス – オスの社会的相互作用試験で明らかに攻撃的な表現型を示すマウス株からの。 親和相互作用の量を最大にするために、実験前に試験動物を隔離します。家は彼らの社会的モチベーションを高めるために3日間3週間（最小14,17に積極的な相互作用を低減するため）と女性（E.エー、未発表データ）ごとに個別に男性が。 （ 例えば、マウスを相互作用として、3.1.3を参照してください）新しいニューカマーとしてそれらを使用する試験株の遺伝的背景の株の代表から男性または女性を取得します。例えば、研究されている変異株は、C57BL / 6Jバックグラウンドで生成された場合、新たなニューカマーとしてC57BL / 6Jマウスを使用します。これらのマウスの各々は、新しいコーナーとしてより1日2回使用されないように、必要な動物の数を計算します。グループでそれらを収容します。 発情期の雌の存在下で男性の発声を記録するために、成体マウスの2種類を取得します。 リットルで入手興味のある株の各遺伝子型から東に12性的に成熟した雄は（アカウント個体間変動を考慮に入れるため）。男性は前に雌と経験を持っていたことがない場合は、個別のケージに入れて超音波発声6を放出するように彼らのモチベーションを高めるために、試験前に女性の2日間で1夜を過ごすそれらを残す：注意してください。 記録された男性のバックグラウンド株からの性的に成熟した雌を入手します。例えば、変異型男性が検討されている場合は、C57BL / 6Jメスを使用し、C57BL / 6Jバックグラウンド上に生成されています。これらのマウスの各々が複数の1日3回使用されないように、必要とされる女性の数を計算します。グループでそれらを収容します。 2.パップアイソレーションコールパップ識別三日誕生の予測日前に、妊娠した雌を分離します。 出産のため、女性毎朝と毎晩を確認してください。 P0として誕生の日に注意してください。 （0.3ミリメートルX 13ミリメートル[30 G½ "]針でペースト緑タトゥーの皮下注射）長期的な足の入れ墨を使用して、P1で子犬を識別します。マークされた1、2、3または4つの足でコードを作成します。のようにして最小限の子犬を妨害し、できるだけ早く巣にそれらを戻すために、可能な限り迅速に。 録音パップ分離コールにケージを設定します。 自作防音室（ 図1A）または単純な発泡スチロールの箱のどちらかを使用します。各記録のための温度を監視するために、箱の中に温度計を配置します。温度は18℃〜22℃の間に残っていることを確認してください。 （ボックスの上部の穴を通って）上部にマイクを置きます。マイクの膜は12〜15センチメートル子犬が横たわりますボックスの下部より上にあるように、マイクの高さを調整します。コンピュータにサウンドカードにマイク、サウンドカードを接続します。 荘のゲインを調整するにはNDカード、実験に使用されることはありません子犬と記録トライアルを実施しています。実験（2.3.1を参照）と同様の条件で子犬を置きます。ドアを閉める。それが最大値になるように、サウンドカードのゲインを調整します（発声のための可能な最大振幅を持っている）が、過負荷を与えず（記録ソフトでライブスペクトログラム表示で確認してください）​​。 注：コールの大部分の振幅は可能な限り高いレベルで維持されている場合、いくつかのコールが過負荷になる可能性があります。 各記録セッションのゲインレベルを登録し、仔/リットル/セッション間でそれを変更しないでください。ゲインレベルの変動は、不正確な呼び出し検出と自動検出し、測定を（5.4から5.1を参照）を用いた解析で同じ閾値と音響変数対策につながります。 <strオング>図1：アイソレーションを記録するための設定は、仔マウスと超音波発声のスペクトログラムから呼び出す子犬分離通話を記録するために自作防音室の（A）の例。。現在のコールタイプの分類に使用されるさまざまなコールタイプの（B）スペクトログラム。表1に説明を参照してください。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 子犬の分離の記録は2日ごとに呼び出して行います。夜に生まれた仔のために午前中にレコーディングを行い、年齢差の半日と同じ年齢のクラスの子で分類を回避するために、日中に生まれ子犬のために午後インチこれは非常に若い段階P2とP4のために最も顕著です。 リターの1子犬を取ります。エタノール10％で洗浄し、乾燥したプラスチック製の受信者に早く、軽く、できるだけそれを置きます（直径：9cm;高さ：10 cmマイクがカバーするエリア）から逃げるの古い子犬を防ぐために。ちょうどマイクの下に受信者を置きます。 迅速かつ静かにできるだけボックスを閉じます。記録ソフトウェアの子犬超音波発声の録音を開始します（16ビットフォーマットは、300 kHzのサンプリング周波数は、高品質で150 kHzまでの音の振幅を捕捉します）。 記録の所要時間は（5分まで）が経過した後に、録画を停止します。箱の外に子犬を取ります。子犬の足の入れ墨を書き留めます。 プローブ温度計と子犬の腋窩温度を取ります。マークより簡単に臭いレスペン（水性インク）、認識すると小さな点とその背中に子犬次のいずれかが選択され、新しいものがあるたびに、すべての子犬を操作避けるために、巣の中既に記録仔選ばれました。巣に子犬を元に戻します。 10％のエタノールでその底部を覆っているプラ​​スチック製の受信者とプラスチックを洗い、よく乾かし内部次の子犬を入れてください。 ごみの次の子犬を選択し、2.3を繰り返します。 可能にするために1時間の残りの期間の後に（ ら 19 Eyのシュマイサーら 18内とのメソッドのセクションを参照してください減少試験電池の詳細については）体重、運動協調性、負の走地性、および発生マークをチェック子犬は、超音波発声の排気エミッション後に回復します。このようなChadman ら 20とScattoni ら。21のように完全な発達テスト用電池が行われた場合、動物の別のコホートを使用してください。 生活の最初の2週間を通して子犬ボーカル行動と発達を特徴づけるためにこれらの記録をP2とP12との間に2日ごとに繰り返します。 3.超音波発声同性ソーシャルインタラクション中発声レコーディングテストケージを準備（50×25センチメートル×30 Cメートル3;プレキシグラスは、100ルクス[低強度の白色光]）、石鹸水で洗浄、乾燥し、防音室で2センチメートル新鮮な寝具を充填しました。 ケージのすべてのコーナーから放出された発声を記録することができるようにマイクを置きます。テストケージ（ケージのか、三脚上のいずれか）の隅にマイクを修正し、ケージの表面全体を覆​​うように、角度マイク・ケージの底を調整します。 注：超音波は非常に指向しています。 テストケージの表面全体をキャプチャするために防音室の上部にビデオカメラを置きます。 注：マイクはビデオでテストケージの隅に隠れていないか確認してください。 テストの前に、予備の男性とそれ以降の実験に使用されない予備の女性とサウンドカードのゲインを調整します。記録チャンバー内の試験ケージにこれらの動物を入れてください。記録された発声の振幅を最大化するために、サウンドカードのゲインレベルを調整府tは録音ソフトウェアでライブスペクトログラム表示で見られるように過負荷を最小限に抑えることができます。 注：ゲインはマイクと発声動物との間の距離に依存します。 新鮮な寝具上のテストケージに、（それは「乗員」と呼ばれるオスまたはメス）を試験するために動物を紹介します。 3.1.3で導入された未知の同種のためにその関心を最大化するために20分間、防音室での試験ケージに慣らすことにしておきます。 この馴化時間の後、対話のための第2の動物を紹介する（後でそれらを識別するために、男性または女性、乗員と同じ性別が、異なる耳マーク/足のタトゥー、それは「新しいカマー」と呼ぶことにします）。 テストケージに新コーナーの導入をキャプチャするとビデオ（150高品質でkHzまでの音の振幅を捕捉するために16ビット形式、300 kHzのサンプリング周波数）の超音波発声の記録を開始します。 uの記録を開始ケージの探査と社会的相互作用の間に発声発光のベースラインレベルとの比較が必要な場合に慣れ（単独乗員）中ltrasonic発声。 時間時計の新コーナーマウスの後肢が地面に触れ正確に（マイクの近くに「BIP」音）を押すことにより、手動/視覚的にオーディオとビデオの録画を同期します。 （例えば4分、十分な超音波発声を収集するのに十分な期間にわたって）所望の時間に相互作用2匹の動物を残します。 それぞれのホームケージに戻って、乗員と新コーナ​​ーを置きます。テストケージから使用寝具を空にし、石鹸水で洗浄し、ペーパータオルでそれを乾燥させます。新鮮な寝具を入れて、次のテストのための防音室の中に戻って置きます。 4.男性発声発情女性との相互作用の間に早朝にテストの日男性は、発情周期内での性的状態を決定するために、各女性からの膣スメアを取ります。 尾によって女性を持ち、ケージグリッド上に彼女を維持します。 20μlのPBS（ すなわち 、同じ20μlのPBSを注入し、思い出す数回）で膣数回すすぐためにピペットを使用してください。同じピペットチップで20μlのPBSを思い出し。女性が数日間連続して試験される場合、任意の感染を避けるために、滅菌PBSを使用。 スライド上の膣細胞の懸濁液を含むPBSを広げます。 （鉛筆でスライド側の個人を識別）1スライド上の4つのサンプルを置きます。スライドは染色を行う前に乾燥してみましょう。 実験室ヒュームフードの下で働きます。 純粋なメイグリュンワルドの1浴、リン酸緩衝液（0.1 M）の1バス、ギムザR（リン酸緩衝液中の1月20日）の1浴を準備します。 その後、3分間純粋なメイ・グリュンワルドの浴にスライドを置きます1分間、リン酸緩衝液の浴中でそれらを洗浄し、最後にギムザR（リン酸緩衝液中の1/20）の浴中で10分間移します。 その後、10秒間リン酸緩衝液の浴に再びスライドをすすぎ、それらを乾燥させてください。 顕微鏡下で染色したスライドを調べます。 （;完全発情青で染色された核のない、）日中に使用することができる女性は、そのサンプルに存在する唯一の大規模な角化上皮細胞のものです。 それらをテストする前に試験室に少なくとも30分で男性を置きます。 発声レコーディング必要に応じて3.1を繰り返します。 （新鮮な寝具に）試験されるべき男性をご紹介します。彼は10分間防音室での試験ケージに慣らすのままにします。 この馴化時間の後、（染色から選択したものの中で）発情期の女性を紹介します。 超音波発声やビデオの録画を開始テストケージの女性の導入をキャプチャします。ケージの探査と社会的相互作用の間に発声発光のベースラインレベルとの比較が必要な場合は（男性単独）馴化の間に超音波発声の記録を開始します。 時間時計にメスのマウスの後肢が地面に触れ正確に（マイクの近くに「BIP」音）を押すことにより、手動/視覚的にオーディオとビデオの録画を同期します。 （例えば4分、十分な超音波発声を収集するのに十分な期間にわたって）所望の時間に相互作用2匹の動物を残します。 それぞれのホームケージにオスとメスを元に戻します。テストケージから使用寝具を空にし、石鹸水で洗浄し、ペーパータオルでそれを乾燥させます。新鮮な寝具を入れて、次のテストのための防音室の中に戻って置きます。 毎日各発情期の雌を一度だけ使用することが最適である（ただし、必要であれば、それは次のことができます。注意して​​ください同じ日にではなく）の行に3回まで使用すること。 5.変数抽出します分析のためのオーディオファイルを準備します。注：以下の手順はvisoft SASLabプロに固有のものであり、使用されるソフトウェアに応じて変更されることがあります。 彼らは時間の時計の「BIP」で正確に開始し、（子犬の録音、大人の録音のための4分5分）所望の期間後に終了するようにファイルをカットします。 （; 30 kHzの周波数を持つハイパスカットオフ[編集]> [フィルター]> [FIRタイムドメインフィルタ）は、ハイパスフィルタを用いて、30 kHzの下での振幅をフィルタリングします。関心（アクション]> [バッチ処理> FIRフィルタ）のすべてのファイルをフィルタリングするためにバッチ処理を使用してください。 ソフトウェアでそれらを標識することにより、各超音波発声を識別します。 （波形イベントからセクションラベルを作成]> [ツール]> [ラベル）子犬の録音のための自動検出を使用してください。しきい値を調整し、時間と余裕Fを保持しますまたは最も正確な検出。手動検出を確認し、（推奨）必要に応じてラベルを調整します。 （、発声を選択し、右クリックして、マーカーからセクションラベルを挿入する）バックグラウンドノイズを持つ大人の記録のために視覚的検出（ラベルの手動挿入）を使用します。 スペクトログラムを作成します。自動パラメータ測定値（[ツール]> [パラメータ自動測定>パラメータ自動測定の設定）を有効にします。 「有効自動測定」、「全体のスペクトログラムから計算パラメータ」、および「自動更新」チェックボックスをオンにします。対話的（セクションラベル）：「エレメントの分離」を選択します。 希望の時間的なパラメータ（要素の持続時間、間隔、開始/終了時間）とスペクトルに基づくパラメータ（ピーク周波数）、および測定値の位置（要素の開始、要素の終了、平均値、最大値、最小値）を計算するためにチェックボックスをオンにします。 測定値をコピーして貼り付けますスプレッドシートのメートル。 注意：大人に行っ記録のために、スペクトルベースの​​パラメータの測定があるため、バックグラウンドノイズのは不可能かもしれません。スペクトログラム上で直接異なる周波数値をクリックし、テーブル内の値を手動で貼り付けることにより、ピーク周波数の手動測定を使用してください。 最初の（ラベル数の合計）放出された発声の数を決定することによって、コールレート、分ごとのコールのすなわち、数を決定します。次に、ファイルの（分単位）持続時間によって記録された発声の合計数を割ることによって、コール・レートを計算します。 シーケンスの組織を決定するための呼び出しの間の時間間隔の時間的な組織、 すなわち 、分布を決定します。 各ラベルの開始/終了時間を使用して発声の終わりnおよび発声の開始n + 1の間の時間間隔を算出します。 ウルトラ間の時間間隔の分布密度を確立しますIC発声。 コールのレパートリーを決定する、 すなわち、記録に存在するコールタイプを定義します。 表1および図1Bに示された分類の例を使用してください。 5.1.3に各発声を標識すると、ラベルにコールタイプの名前を書きます。 ボーカルのレパートリーを構築するために正確な数と各コールタイプの割合を計算します。 自動測定が可能である場合は、各発声、 すなわち、持続時間、ピーク周波数に対する音響特性を決定する（ すなわち、最大振幅の周波数）初めに、通話、最大と最小のピーク周波数の終わり、とは周波数を意味する（ 図1B） 。 自動的に時間を測定するためのソフトウェアで自動パラメータ測定機能を使用して、ピーク周波数特性（ 例えば 、開始、終了、平均値、最大値、最小値）子犬の録音インチ</li> 大人の録音のための発声の期間として、ラベルの長さを使用してください。スペクトログラム・ウィンドウに手動で測定したピーク周波数特性（ 例えば、開始、終了、最大値、最小値）。 カップル超音波発声データと社会的相互作用データ（ICYプラットフォーム22からMiceProfilerプラグイン）。 プロトコールに記載されているようにできるだけ正確にオーディオおよびビデオ録画を同期することを確認します。 ショーモンら 22に記載されているようにICYプラットフォームのマウスプロファイラトラッカープラグインを使用して、社会的相互作用のビデオをエンコードします。導入された動物の後足が地面に触れたときに正確に追跡を開始します。 ショーモンらに記載されているようにICYプラットフォームのマウスプロファイラビデオラベルメーカーのプラグインでエンコードされたビデオファイルと（ マウスプロファイラトラッカーによって生成された）、それに対応するxmlファイルをアップロードアル。22。 注：それらが同じ名前を持っている場合、マウスプロファイラビデオラベルメーカーのプラグインが自動的にビデオファイルやオーディオファイルの解析から生成されたテキストファイルをリンクします（参照：http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Mice_Profiler_Video_Label_Makerを） 。 マウスのスケールが正しいことを確認した後、数や区切りファイル内の各社会的事象の間に放出された発声の割合を得るために、ファイルごとに "USV統計の作成」をクリックしてください。 mouseTubeデータベース 6.ファイルのアップロードファイルは機関の外部からアクセス可能なストレージサーバにあることを確認します。 注：セキュリティレベルの高いいくつかの施設でホストされているサーバーは、施設の外から接続する人々によってアクセスできるように、特定の構成が必要になります。 mouseTubeのウェブサイト（http://mousetube.pasteur.fr）に移動します。ログイン（ログインしますNDパスワード）は、管理者が各ユーザに帰属されます。 既に記録されたマウス系統は、「株」ボタンをクリックしてmouseTubeデータベースに存在するかどうかを確認してください。ない場合は、それを作成するために、管理者に依頼してください。 ボタンを「作成>科目」を使用して被験者を作成します。記録された動物の識別コードを入力します。データの後の検索を容易にするためのグループでそれらを収集します。 ボタンを ">プロトコル作成」を用いた超音波発声を記録するために使用されるプロトコルの説明を入力します。 ボタンを「作成>実験」を使用して、各記録セッションのための実験を​​作成します。プロトコル、記録された個人のグループ、使用するハードウェアとソフトウェアとその特異性を指定します。 注：この実験は、発声ファイルに対応するすべてのメタデータを収集します。 「発声を使用して、発声のファイルへのリンクを作成]> [作成＆＃34;ボタン。リスト内の実験を選択します。コピーして発声ファイル（このリンクはhttpで始まる：// …）のURLを貼り付けて、列を「リンクするファイル」の対応するフィールドに。 「mouseTubeとファイル間のリンクを作成」ボタンをクリックしてエントリを検証します。 注：同時に、各ファイルの各ボックスを満たすために必要とされません。 必要に応じて、任意の時点で入力されたリンクを変更し、「注意」の項で詳細を追加。より詳細な情報を与えるためにメモを書き留めることを躊躇しないでください。オーディオファイルと同時に記録された映像ファイルに向けてリンクが入力されている場合たとえば、これは「ノート」で指定することができます。