JoVE Journal > Behavior
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Behavior

הקלטת עכבר Ultrasonic קולות של להערכת תקשורת חברתית

Published: June 05, 2016
doi:
10.3791/53871
, , , , , , ,
1Human Genetics and Cognitive Functions,University Paris Diderot, CNRS UMR 3571, Institut Pasteur, 2Neurophysiology and Behavior,University Pierre et Marie Curie Paris 6, CNRS UMR 7102, 3Bio Image Analysis,CNRS URA 2582, Institut Pasteur

Summary

Mouse ultrasonic vocalizations are used as proxies to model the genetic bases of vocal communication deficits in mouse models for neuropsychiatric disorders. The present protocol describes three experimental contexts that reliably elicit ultrasonic vocalizations from pups (throughout development) and adult mice (same-sex interactions, male-estrus female interactions).

Abstract

Mice emit ultrasonic vocalizations in different contexts throughout development and in adulthood. These vocal signals are now currently used as proxies for modeling the genetic bases of vocal communication deficits. Characterizing the vocal behavior of mouse models carrying mutations in genes associated with neuropsychiatric disorders such as autism spectrum disorders will help to understand the mechanisms leading to social communication deficits. We provide here protocols to reliably elicit ultrasonic vocalizations in pups and in adult mice. This standardization will help reduce inter-study variability due to the experimental settings. Pup isolation calls are recorded throughout development from individual pups isolated from dam and littermates. In adulthood, vocalizations are recorded during same-sex interactions (without a sexual component) by exposing socially motivated males or females to an unknown same-sex conspecific. We also provide a protocol to record vocalizations from adult males exposed to an estrus female. In this context, there is a sexual component in the interaction. These protocols are established to elicit a large amount of ultrasonic vocalizations in laboratory mice. However, we point out the important inter-individual variability in the vocal behavior of mice, which should be taken into account by recording a minimal number of individuals (at least 12 in each condition). These recordings of ultrasonic vocalizations are used to evaluate the call rate, the vocal repertoire and the acoustic structure of the calls. Data are combined with the analysis of synchronous video recordings to provide a more complete view on social communication in mice. These protocols are used to characterize the vocal communication deficits in mice lacking ProSAP1/Shank2, a gene associated with autism spectrum disorders. More ultrasonic vocalizations recordings can also be found on the mouseTube database, developed to favor the exchange of such data.

Introduction

מטופלים עם הפרעות נוירו-פסיכיאטריות בדרך כלל להציג גירעונות בתקשורת חברתית (למשל, חולים עם הפרעות בספקטרום האוטיזם, סכיזופרניה, או מחלת אלצהיימר) 1. מהונדסים גנטיים עכברים הם לעתים קרובות יותר ויותר לשמש מודל גורמים גנטיים של הפרעות אלה 2. לימוד תקשורת חברתית במודלים של עכברים אלה הוא של ריבית גבוהה עבור להבנת המנגנונים של מוטציות גנטיות ההוביל תפקוד חברתי לא טיפוסי לבדיקת טיפולים חדשים. מאז עכברים הם חיות חברתיות ולתקשר עם כל האחרים באמצעות חוש ריח, מישוש, אותות חזותיים ואקוסטי, הם מודלים מתאימים להעריך תקשורת חברתית.

קולות קולי עכבר נמצאים כיום בשימוש כיום כמו פרוקסי למידול הבסיסים הגנטיים של גירעונות תקשורת קוליים 3,4 (אבל קיומה של למידה ווקאלית מין זה עדיין במחלוקת 5,6, גם אם רוב המחקרים האחרונים arguדואר עבור בהעדר למידה ווקאלית 7). עכברי מעבדה נמצאו לפלוט קולות קוליים במערכות יחסים אם-תינוק, באינטראקציות חברתיות-מיניות בין גברים לנשים, באינטראקציות חברתיות חד-מיניות (הנסקרת תוך התייחסות 8) ו באינטראקציות חברתיות-לנוער לנוער 9. עכבר גורים פולטים שיחות בידוד במהלך השבועות הראשונים לחייהם כאשר מבודד סכר להמלטה 10. זכרים פולטים קולות קוליים כאשר בנוכחות נקבת ייחום (או רמזי שתן ממנה) 11,12. זכרים ונקבות לפלוט ניקוד קולי בעת אינטראקציה עם conspecific ידוע מאותו המין 13,14. הארגון והפונקציות של קולות אלה אינם ברורים לחלוטין וזקוקים חקירות נוספות. ידע נוכחי על ההיבט התפקודי מוגבל ההתמחרות של התנהגות תחזור אמהות לשמוע שיחות בידוד גור, ההנחיה של קרבה של נשים בוגרות כלפי vocalizat זכר הבוגריוני 15 ואת התנהגות גישוש המוגברת זכרים בוגרים לשמוע קולות נקבה בוגר 16.

אפיון חריגויות תקשורת קולית בעכברי מודל של הפרעות נוירופסיכיאטריות צריכה להתנהל בתנאים סטנדרטיים כדי לשלול תרומה משמעותית של תנאי הניסוי. אפיונים כאלה, בשילוב עם ההערכה של אינטראקציות חברתיות סימולטני ומחקרי נוירו-ביולוגיים, במודלים גנטיים שונים צריכים לשפר את הידע שלנו על התרומה הגנטית להיבטים השונים של תקשורת העכבר קולית. במהלך לטווח ארוך, הוא אמור לתת אור נוסף על בסיסים הנוירוביולוגי כלשהי של תקשורת חברתית בבני אדם. אנחנו כיום שואפים לספק פרוטוקולים פשוטים לעורר קולות קוליים אמין בעת ​​פיתוח בבגרות הוא עכברי הזכרים ונקבה במעבדה. פרוטוקולים כאלה צריכים להקל על סטנדרטיזציה של הקלטות כדי להשוות באופן מהימן יותר ultrפליטת ניקוד asonic בין זנים ומעבדות. ראוי גם להקל על הקמת הקלטות כאמורות במעבדות שיש ללא ניסיון קודם עם הקלטות קולות קולי עכבר. כמו כן, אנו מדגישים את האפשרות הנוכחית לשלב נתונים קולות קוליים עם נתונים התנהגותיים מפורטים שנאספו בו זמנית במהלך האינטראקציות חברתיות בעכברים בוגרים, כדי להשיג מידע חיוני על ליקויים חברתיים וכן על ההקשר של פליטה של ​​קולות קוליים. ניתוחים כאלה שישפכו אור חדש על הארגון והפונקציות של קולות קולי עכבר. לבסוף, אנו גם לפרסם את האפשרות לשתף קלטות ניקוד קוליות עם הקהילה המדעית כולה על מסד נתוני mouseTube (http://mousetube.pasteur.fr). גישה פתוחה נתוני הקלטת שמע צריכה להרחיב את הידע על תקשורת עכבר קולית בכך שהוא מאפשר למדענים להשוות נתונים משלהם עם קולות קוליים נרשמים labo האחרratories (עם זנים דומים או שונים / פרוטוקולים), ו / או לקרוא תיגר על שיטות הניתוח שלהם עם קבצים המוקלטים בתנאים שונים.

Protocol

הצהרה אתיקה: הנהלים הקשורים בנושאים בעלי חיים אושרו על ידי Comité d'en Ethique ניסויים animale (CETEA) n ° 89 על מכון פסטר, פריז. 1. הכנת בעלי חיים כדי להקליט שיחות בידוד גור, להשיג נקבות בהריון מן זן העכבר של עניין. הערה: בריד זכרים ונקבות הטרוזיגוטיים להשיג לפחות 10 המלטות כולל wild-type, הטרוזיגוטיים ו עקום החוצה גורים להשיג חיות בקרה חזקות. השג שתי קטגוריות של עכברים בוגרים להקליט קולות במהלך אינטראקציות בין בני אותו מין. להשיג לפחות 12 זכרים או נקבות 12 של כל גנוטיפ כמו עכברים מבחן מהלחץ של עניין (להביא השתנות חשבון בין הפרט). הערה: פרוטוקול זה הוא מותאם גם למבוגרים, אבל זה יכול להיות מותאם קטינים, עם זמן בבידוד מופחת לפני הניסוי 9. בדיקה זו עובדת עבור זכרים או נקבות. עם זאת, להימנע זכר בדיקותים מן זנים עכבר המציגים פנוטיפ אגרסיבי ברור במבחן אינטראקציה חברתית בין גברים. כדי למקסם את כמות האינטראקציות affiliative, לבודד את חיות הבדיקה לפני ניסויים. בית הזכרים בנפרד במשך 3 שבועות (כדי להפחית את אינטראקציות אגרסיביות על 14,17 מינימום) ונקבות במשך 3 ימים (א Ey, נתונים שלא פורסמו) כדי להגביר את המוטיבציה החברתית שלהם. השג זכרים או נקבות מנציג זנים של הרקע הגנטי של זן הבדיקה להשתמש בהם כמו-פינות חדשות (למשל, כמו עכברים אינטראקציה, ראה 3.1.3). לדוגמה, אם בזן העכברים המוטנטים הנלמד נוצר על רקע C57BL / 6J, משתמשים בעכברים C57BL / 6J כמו-פינות חדשות. חשב את מספר בעלי החיים הנדרשים כדי שכל אחד עכברים אלה אינו משמש יותר מ -2 פעמים ביום כמו-פינה חדשה. בית אותם בקבוצות. השג שתי קטגוריות של עכברים בוגרים להקליט קולות זכר בנוכחות נקבה ייחום. השג ב lמזרח 12 זכרים בוגרים מינית מכל גנוטיפ של הזן של עניין (להביא השתנות חשבון בין פרט). הערה: אם הזכרים מעולם לא היו לי ניסיון עם נקבות לפני, לשים אותם בכלובים בודדים ולהשאיר אותם לבלות לילה אחד עם ימים נקבה לפני הבדיקה כדי להגביר את המוטיבציה שלהם לפלוט קולות קולים 6. השג נקבות בוגרים מינית מן זן הרקע של הזכרים המוקלטים. לדוגמא, אם זכרי המוטציה נלמדים נוצרו על רקע C57BL / 6J, השתמש C57BL / 6J נקבות. לחשב את מספר הנקבות הצורך, כך שכל העכברים הללו אינו משמש יותר מ -3 פעמים ביום. בית אותם בקבוצות. 2. שיחות בידוד כלבון זיהוי כלבון שלושה ימים לפני היום החזוי של לידה, לבודד את הנקבות בהריון. בדוק את הנקבות ללידה כל בוקר וכל ערב. הערת יום הלידה כפי P0. זהה את הגורים ב P1 באמצעות קעקועים לטווח ארוכים כפה (הזרקה תת עורית של קעקוע ירוק להדביק עם 0.3 מ"מ x 13 מ"מ [30 G ½ "] מחט). יצירת קוד עם אחד, שתיים, כפות שלוש או ארבע מסומנים. היית מהר ככל האפשר, להפריע את הגורים מינימאליים, ומחזיר אותם בקן בהקדם האפשרי. הגדר את קייג 'שיחות בידוד כלבון שיא. השתמש באחת תא לרעש מתוצרת עצמית (איור 1 א) או קופסת קלקר פשוטה. מניח מדחום בתוך התיבה כדי לנטר את הטמפרטורה עבור כל הקלטה. ודא כי הטמפרטורה נשארת בין 18 ° C ו- 22 ° C. מניח מיקרופון בחלק העליון (דרך חור בחלק העליון של הקופסה). התאם את גובה של המיקרופון כך הממברנה של המיקרופון הוא 12-15 ס"מ מעל החלק התחתון של התיבה שבה את הגור יהיה לשכב. חבר את המיקרופון לכרטיס הקול, ואת כרטיס הקול במחשב. כדי לכוונן את הרווח של סוnd כרטיס, לביצוע ניסוי הקלטה עם גור כי לא ייעשה שימוש בניסוי. שים את הגור באותם תנאים כמו בניסוי (ראה סעיף 2.3.1). סגור את הדלת. התאם את הרווח על כרטיס הקול, כך שזה על הערך המקסימאלי (יש משרעת הגבוהה ביותר האפשרית עבור הקולות) אבל בלי להעמיס (לבדוק בתצוגת ספקטרוגרמה חיה על תוכנת הצריבה). הערה: כמה שיחות ייתכן שיש עומס יתר אם משרעת של רוב השיחות נשמרת ברמה הגבוהה ביותר האפשרית. רשום את רמת הרווח עבור כל הקלטות ואל תשנה אותו בין גורים / המלטות / הפעלות. לשינויים ברמות רווח יובילו זיהוי שיחה מדויק ואמצעים משתנים אקוסטי עם אותה ספי הניתוחים באמצעות זיהוי אוטומטי ומדידות (ראה 5.1 ל 5.4). <strאונג> איור 1: הגדרת הקלטת בידוד שיחות גורי עכבר ספקטרום של קולות קוליים (א) דוגמא של תא מתוצרת עצמית אטום לרעש להקליט שיחות בידוד גור.. (ב) ספקטרום של סוגי השיחות השונים המשמשים לסיווג סוג השיחה הנוכחי; ראה תיאור בטבלה 1. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. לנהל את ההקלטה של ​​בידוד הגור קורא כל יומיים. לנהל הקלטות בבוקר עבור גורים שנולדו הלילה, ואחר הצהריים עבור גורים שנולדו במהלך היום, כדי למנוע לקטגוריות באותה גורים בכיתת גיל עם חצי יום של פער גילים. זה הכי בולט עבור P2 ו- P4 בשלבים צעירים מאוד. קח גור אחד הגורים. מניחים אותו במהירות ובעדינות ככל האפשר נמען פלסטיק לשטוף עם אתנול 10% מיובשים (קוטר: 9ס"מ; גובה: 10 ס"מ כדי למנוע גורים מבוגרים לברוח מן האזור המכוסה על ידי המיקרופון). שים את הנמען ממש מתחת המיקרופון. סגור את התיבה במהירות ובשקט ככל האפשר. להתחלת ההקלטה של ​​קולות קולי הגור בתוכנת הצריבה (בפורמט 16-bit, 300 תדר הדגימה kHz ללכוד משרעת קול עד 150 kHz עם איכות גבוהה). לאחר זמן הקלטה הנדרש שחלף (עד 5 דקות), להפסיק את ההקלטה. קח את הגור מחוץ לקופסה. רשום את קעקועי הכפה של הגור. קח את הטמפרטורה בבית השחי של הגור עם מדחום-בדיקה. סמן את הגור על גבו עם נקודה קטנה עם עט ריח-פחות (דיו מים), להכיר יותר בקלות את הגורים רשמה כבר בתוך הקן אם הציור הבא נבחר וכדי למנוע מניפולציה כל הגורים בכל פעם אחד חדש הוא נִבחָר. שים את הגור בחזרה לקן. שטפו את הנמען פלסטיק את כיסוי הפלסטיק התחתון שלה עם אתנול 10% ולייבשו היטבלפני שמכניסים את הגור הבא בפנים. בחר את הגור הבא ההמלטה וחזור 2.3. בדוקים משקל גוף, קואורדינציה מוטורית geotaxis השלילית, וסימני התפתחותית (לפירוט של סוללת המבחן המופחתת ראה את קטעי השיטה שמייסר et al. 18 וב Ey et al. 19) לאחר תקופה של מנוחה של שעה 1 כדי לאפשר הגורים להתאושש לאחר פליטת המתיש של קולות קוליים. השתמש עוקבה אחרת של בעלי חיים אם סוללת מבחן התפתחותי המלאה כגון ב Chadman et al. 20 ו Scattoni et al. 21 מתנהלת. חזור על הקלטות האלה כל ימים בין P2 ו P12 לאפיין התנהגות גור ווקאלי ופיתוח ברחבי השבועות הראשונים לחייהם. 3. Ultrasonic קולות של במהלך אינטראקציות חד-מיניות חברתיות קלטות ניקודו הכינו כלוב הבדיקה (50 x 25 ס"מ x 30 גמ '3; פרספקס, 100 לוקס [אור לבן בעוצמה נמוכה]) לנקות עם מים וסבון, יבשים מלאים מצעים טריים 2 ס"מ בתא לרעש. הצב את המיקרופון כך קולות הנפלטות מכל קצות הכלוב ניתן להקליט. תקן את המיקרופון בפינת הכלוב הבדיקה (בין אם על הכלוב או על חצובה) ולהתאים התחתון זווית מיקרופון הכלוב כדי לכסות את כל פני השטח של הכלוב. הערה: אולטרסאונד הם מאוד כיוונית. מניח מצלמת וידאו על גבי התא לרעש כדי ללכוד את כל פני השטח של כלוב הבדיקה. הערה: בדוק שהמיקרופון לא מסתיר בפינת הכלוב מבחן על וידאו. לפני הבדיקה, להתאים את הרווח של כרטיס הקול עם זכר חילוף ונקבת חילוף כי לא ייעשה שימוש בניסוי מאוחר יותר. שם חיות שבכלוב הבדיקה בחדר ההקלטה. התאם את רמת הרווח של כרטיס הקול על מנת למקסם את המשרעת של הקולות רשמו but כדי למזער עומס יתר כפי שניתן לראות בתצוגת ספקטרוגרמה חיה על תוכנת הצריבה. הערה: הרווח תלוי במרחק בין מיקרופון החיות לומר בדיבור. הצג את החיה להיבדק (זכר או נקבה, זה ייקרא "הכובש") בכלוב המבחן על מצעים טריים. תשאיר את זה להרגיל לכלוב הבדיקה בחדר האטום לרעש במשך 20 דקות על מנת למקסם את האינטרס שלה עבור conspecific הידוע הציג 3.1.3. לאחר זמן התרגלות זה, להציג את חית 2 nd לאינטראקציה (זכר או נקבה, מיניו של הכובש, אך סימני אוזן שונים / קעקוע כפה לזהות אותם מאוחר יותר; זה ייקרא "-הפינה החדשה"). התחל הקלטת הקולות הקוליים (בפורמט 16-bit, 300 תדר דגימת kHz ללכוד משרעת קול עד 150 kHz עם איכות גבוהה) ואת הווידאו כדי ללכוד את ההקדמה של הפינה החדשה בכלוב הבדיקה. התחל קלטת uקולות ltrasonic במהלך ההרגלה (הכובש לבד) אם השוואה בין רמת הבסיס של פליטת ניקוד במהלך חיפושי כלוב האינטראקציה החברתית היא זקוקה. סנכרון ידני / ויזואלית את הקלטות וידאו ואודיו על ידי לחיצה על שעון הזמן ( "ביפ" קול ליד המיקרופון) בדיוק כאשר רגליו האחוריות של העכבר החדש-הפינה לגעת בקרקע. השאר שתי חי אינטראקציה בפעם הרצויה (עבור דקות למשל 4, פרק זמן מספיק כדי לאסוף קולות קוליים מספיק). שים את הדייר ואת-הפינה החדשה בחזרה אל תוך הכלובים הביתה שלהם. רוקן את המצעים בשימוש מכלוב הבדיקה, לשטוף אותו עם מים וסבון לייבש אותו עם נייר סופג. שימו מצעים טריים ולמקם אותו בחזרה בתא לרעש לקראת המבחן הבא. 4. זכר קולות של במהלך אינטראקציה עם נקבת ייחום מוקדם בבוקר היום של בדיקותזכרים, לקחת מריחות נרתיק מכל נקבה כדי לקבוע את מצב המין שלהם בתוך הייחום. החזק את הנקבה בזנב ולשמור אותה על הרשת בכלוב. השתמש פיפטה לשטוף את הנרתיק פעמים מספר עם 20 PBS μl (כלומר, להזריק ומעלה בזכרוני פעמים באותו 20 μl PBS כמה). לזכור את PBS 20 μl עם אותו קצה פיפטה. השתמש PBS סטרילית, כדי למנוע זיהום אם נקבות להיבדק במשך כמה ימים רצופים. מורחים את PBS המכיל את ההשעיה של תאים בנרתיק בשקופית. שים ארבע דגימות בשקופית אחת (לזהות את האנשים בצד של השקופית בעיפרון). בואו השקופיות להתייבש לפני ביצוע מכתים. עבודה מתחת למכסה המנוע קטר מעבדה. כן אמבט אחד במאי-גרונוולד טהור, אמבטיה אחד של פתרון חיץ פוספט (0.1 מ ') ואמבט אחד Giemsa R (1/20 בתמיסת חיץ פוספט). שים את השקופיות באמבטיה של מאי-גרונוולד טהור במשך 3 דקות, ולאחר מכןלשטוף אותם באמבטיה של פתרון חיץ פוספט 1 דקות ולבסוף להעביר אותם במשך 10 דקות באמבט של Giemsa R (1/20 בתמיסת חיץ פוספט). לאחר מכן, יש לשטוף את השקופיות שוב באמבטיה של פתרון חיץ פוספט במשך 10 שניות ולתת להם להתייבש. בדוק את השקופיות המוכתמות מתחת למיקרוסקופ. נקבות, שניתן להשתמש בהם במשך היום הם אלה אשר דגימות הנוכחי גדול רק לתאי האפיתל cornified (ללא גרעין, מוכתם בכחול; ייחום מלא). שם הזכרים בחדר הבדיקה לפחות 30 דקות לפני בדיקתם. קלטות ניקודו חזור על 3.1 במידת הצורך. הצג את הזכר להיבדק (על מצעים טריים). עזוב אותו להרגיל לכלוב הבדיקה בחדר אטום לרעש במשך 10 דקות. לאחר זמן התרגלות זה ולהנהגה נשית ייחום (בין אלה שנבחרו מתוך המכתים). התחל הקלטת הקולות הקוליים ואת הווידאוכדי ללכוד את כניסתה של הנקבה בכלוב הבדיקה. התחל הקלטת הקולות הקוליים במהלך הרגלה (זכר בלבד) אם נעשה השוואה בין רמת הבסיס של פליטת ניקוד במהלך חיפושי כלוב האינטראקציה החברתית היא זקוקה. סנכרון ידני / ויזואלית את הקלטות וידאו ואודיו על ידי לחיצה על שעון הזמן ( "ביפ" קול ליד המיקרופון) בדיוק כאשר רגליו האחוריות של העכברה לגעת בקרקע. השאר שתי חי אינטראקציה בפעם הרצויה (עבור דקות למשל 4, פרק זמן מספיק כדי לאסוף קולות קוליים מספיק). שים את הזכר והנקבה בחזרה אל תוך הכלובים הביתה שלהם. רוקן את המצעים בשימוש מכלוב הבדיקה, לשטוף אותו עם מים וסבון לייבש אותו עם נייר סופג. שימו מצעים טריים ולמקם אותו בחזרה בתא לרעש לקראת המבחן הבא. הערה: התרחיש האופטימלי הוא להשתמש בכל נקבה ייחום רק פעם אחת בכל יום (אלא אם יש צורך זה יכוללשמש עד 3 פעמים באותו היום, אך לא ברציפות). 5. משתנה להיעקר הכן קבצי אודיו עבור ניתוחים. הערה: ההליך שלהלן הוא ספציפית visoft SASLab פרו ועשוי להשתנות בהתאם לתוכנה בשימוש. חותך את הקבצים כך שהם מתחילים בדיוק על "ביפ" של שעון הזמן, ולסיים לאחר משך הזמן הרצוי (5 דקה 'להקלטות גור, 4 דקות להקלטות מבוגרות). לסנן את המשרעת מתחת לגיל 30 קילוהרץ באמצעות מסנן גבוה לעבור (Edit> Filter> מסנן מתחם זמן FIR; Pass הגבוהה עם 30 kHz תדירים מנותק). השתמש עיבוד אצווה כדי לסנן את כל הקבצים של עניין (פעולות> עיבוד אצווה> מסנן FIR). זהה כל ניקוד קולי ונתן להן את התוכנה. השתמש זיהוי אוטומטי להקלטות גור (כלים> תוויות <יצירת תוויות מדור מאירועי צורת גל). התאם סף, להחזיק זמן והרווחיות fאו זיהוי המדויק ביותר. ידנית לבדוק את זיהוי ולהתאים תוויות במידת הצורך (מומלץ). השתמש זיהוי ויזואלי (הוספה ידנית של תוויות) להקלטות מבוגרות עם רעש רקע (בחר את הקולות, ללחוץ עליו לחיצה ימנית, וכנס תווית קטע מתוך סמן). צור ספקטרוגרמה. הפעל מדידות פרמטרים אוטומטיות (כלים> מדידות פרמטרים אוטומטיות> מדידות פרמטרים אוטומטיות גדר). בדוק את "מדידות אפשר אוטומטית", "הפרמטרים לחשב מן ספקטרוגרמה כולו", ואת תיבות "עדכון אוטומטי". בחר "ההפרדה אלמנט": באופן אינטראקטיבי (תוויות המדור). תיבות סימון לחשב את הפרמטרים זמניים המבוקשים (משך האלמנט, מרווח, שעת התחלה / סיום) ופרמטרים מבוססי ספקטרום (תדר Peak), ואת המיקום של מדידות (התחל של אלמנט, סוף האלמנט, Mean, מקס, מינ ') . העתק את המדידות ולהדביק אתמ 'בגיליון אלקטרוני. הערה: הקלטות שנערכו עם מבוגרים, מדידות של פרמטרים מבוססי ספקטרום עשויות להיות בלתי אפשריות בגלל רעשי רקע. השתמשו בשיטת מדידה ידנית של תדרים שיא על ידי לחיצה על ערכי תדר שונים ישירות על ספקטרוגרמה והדבקה של ערכים באופן ידני בטבלה. לקבוע שיחת שיעור, כלומר, מספר שיחות לדקה ידי הקביעה הראשונה במספר קולות נפלטים (מספר כולל של תוויות). ואז, לחשב את שיעור הקריאה על ידי חלוקת הסך של קולות שרשמו משך הזמן (בדקות) של הקובץ. לקבוע ארגון זמני, כלומר, חלוקת מרווחי זמן בין השיחות לקבוע ארגון רצף. חשב את מרווחי הזמן בין סוף n ניקוד תחילת n הניקוד + 1 באמצעות שעת ההתחלה / סיום של כל תווית. קבע את צפיפות חלוקת מרווחי הזמן בין מגנטיקולות ic. לקבוע רפרטואר שיחה, כלומר, להגדיר את סוגי השיחות נוכחיים בהקלטה. השתמש בדוגמה של סיווג מוצגים בלוח 1 ואיור 1B. כאשר הקבוצה ומוסיף לכל אחד ניקוד ב 5.1.3, לכתוב את השם של סוג השיחה בתווית. חשבתי את המספר המדויק ואת היחס של כל סוג שיחה לבנות את הרפרטואר ווקאלית. לקבוע מאפיינים אקוסטיים לכל ניקוד, כלומר, משך, תדירות שיא (כלומר, תדירות עם משרעת הגבוהה ביותר) בתחילה וסוף השיחה, תדירות שיא מינימום ומקסימום, ולהתכוון תדירות אם המדידה אוטומטית אפשרית (איור 1B) . השתמש בפונקצית מדידות פרמטרים האוטומטית בתוכנה כדי למדוד משך אוטומטי, מאפיינים תדירים שיא (למשל, התחלה, סוף, ממוצע, מקסימום, מינימום) בהקלטות גור. </li> השתמש משך את התווית כמו משך הניקוד להקלטות מבוגרות. מדוד באופן ידני על חלון ספקטרוגרמה המאפיינים התדירים השיא (למשל, התחלה, סוף, מקסימום, מינימום). זוג נתוני ניקוד קולי ונתוני אינטראקציה חברתית (תוסף MiceProfiler מפלטפורמת ICY 22). הקפד לסנכרן באופן מדויק ככל האפשר את האודיו ואת הקלטות וידאו כמתואר בפרוטוקול. לקודד את הוידאו של אינטראקציה חברתית באמצעות תוסף מעקב Profiler עכברים של פלטפורמת ICY כמתואר de Chaumont et al. 22. הפעל את המעקב בדיוק מתי רגליו האחוריות של החיה הציגה לגעת בקרקע. העלה את קובץ הווידאו מקודד קובץ ה- XML המתאים (שנוצר על ידי עכברים Tracker Profiler) ב plugin Maker תווית וידאו Profiler עכברים של פלטפורמת ICY כמתואר et de Chaumontal. 22. הערה: תוסף Maker תווית וידאו Profiler העכברים באופן אוטומטי לקשר את קובץ וידאו ואת קובץ הטקסט שנוצר מן העיבודים שנעשו מתוך קובץ השמע אם יש להם את אותו שם (ראה: http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Mice_Profiler_Video_Label_Maker) . לאחר הבדיקה כי היקף העכבר נכון, לחץ על "צור USV סטטיסטי" עבור כל קובץ כדי לקבל את המספר ואת חלקם של קולות הנפלטים במהלך כל אירוע חברתי בקובץ מופרד. 6. העלאת קבצים על מסד mouseTube ודא שהקבצים נמצאים בשרת אחסון אשר ניתן לגשת מחוץ למוסד. הערה: שרתים מתארחים במוסדות מסוימים עם רמות אבטחה גבוהה יצטרכו תצורה ספציפית כדי להיות נגיש על ידי חיבור בין אנשים מחוץ למוסד. עבור אל אתר האינטרנט mouseTube (http://mousetube.pasteur.fr). התחבר (התחברסיסמא nd מיוחסת כל משתמש על ידי המנהלים). בדוק אם זן עכבר רשמה כבר קיים במאגר הנתונים mouseTube ידי לחיצה על כפתור "זנים". אם לא, לשאול את המנהלים ליצור אותו. צור נושאים באמצעות "נושאים> צור" כפתור. הזן את קודי זיהוי של החיות מוקלטות. אסוף אותם בקבוצות כדי להקל על אחזור מאוחר יותר של נתונים. הזן את התיאור של הפרוטוקול המשמש להקליט קולות קוליים באמצעות "הפרוטוקולים> צור" כפתור. צור ניסוי עבור כל פגישה הקלטה באמצעות "ניסויים> צור" כפתור. ציין את הפרוטוקול, הקבוצה של אנשים אשר כבר נרשם, החומרה והתוכנה המשומשת הספציפית שלהם. הערה: הניסוי אוסף כל metadata המתאים קבצי הניקוד. צור את הקישור לקבצי הניקוד באמצעות "את הקולות> צור & #34; לַחְצָן. בחר את הניסוי בתוך הרשימה. העתק והדבק את ה- URL של קובץ הניקוד (קישור זה מתחיל ב- http: // …) בשדה המקביל "קבצים לקשר" טור. אמת את הרשומות על ידי לחיצה על הכפתור "יצירת קישור בין mouseTube ואת הקבצים". הערה: לא נדרש למלא כל תיבה עבור כל קובץ באותו הזמן. במידת הצורך, לשנות את הקישורים נכנס בכל רגע, ולהוסיף פירוט בפרק "הערות". אל תהססו לרשום הערות לתת פרטים נוספים. לדוגמא, אם קישור כלפי קובץ וידאו שהוקלט בעת ובעונה אחת עם קובץ אודיו הוזן, זה יכול להיות מצוין "אגרות החוב".

Representative Results

עם הפרוטוקולים הנוכחיים, אנו שאפיינו את התנהגות הקול של עכברים שחסרו ProSAP1 / Shank2, גן הקשור פרעות ספקטרום האוטיסטי (ASD) 23-25. ASD מאופיין גירעונות בתקשורת חברתית והתנהגויות סטריאוטיפיות 1. Shank2 שלנו – / – העכברים מוצגים היפראקטיביות, חרדה מוגברת ו 18,26 תקשורת קולית טיפוסית. ואכן, שציינו כי Shank2 – / – עכברים מוצגים פרופיל התפתחותי טיפוסי קצב הפליטה שלהם של שיחות בידוד גור בהשוואה העקומה בצורה ההפוכה הטיפוסית להמלטת wild-type שלהם Shank2 -. / – עכברים מוצגים שיעור שיחה משופר ב P4 וירידה בשיעור שיחות ב P6 בהשוואה לעכברי wild-type שלהם (איור 2). אנו הבחנו גם מתאפיינים בשיעור שיחות ירד באינטראקציות נקבה מעורב Shank2 – / נקבה – ב comparison עם אינטראקציות מעורבות להמלטת wild-type (איור 2). בדקנו את הרפרטואר של קטגוריות 5 שיחה שונות. זה שנראה שונה בין הגורים (למשל כאן P2, P6 ו P10) ומבוגרים (איור 3). הבדלים הקשורים גנוטיפ היו משמעותיים בעיקר בבגרות. במהלך אינטראקציות חברתיות מעורבים מבוגרים Shank2 – / – זכרים או נקבות עם נקבה C57BL / 6N, שיחות קצרות יותר ושיחות בלתי מובנה נרשמו בהשוואה אינטראקציות מעורבים להמלטה wild-type שלהם (איור 3D ו- E). פחות מורכבות שיחות ותדירות קופצות שיחות גם נרשמו במהלך אינטראקציות עם נקבת C57BL / 6N המעורב Shank2 המבוגר – / – נקבות בהשוואת האינטראקציות המעורבות Shank2 + / + נקבות (איור 3E). לבסוף, אנו גם למדוד משתנים אקוסטי ידני. לא היה קשור גנוטיפ משמעותי הבדל duפיתוח טבעת. לעומת זאת, משך השיחות שנרשמו במהלך האינטראקציות המעורבות Shank2 המבוגר – / – הנקבות היו קצרות מאלה שנרשמו במהלך האינטראקציות המעורבות להמלטת wild-type שלהם (איור 4 א). הגשנו גם כי תדירות השיא של קולות קוליים מוגברת במהלך ההתפתחות גור בלי הבדל לפי גנוטיפ משמעותי 26. במהלך האינטראקציות המעורבות Shank2 – / – זכרים או נקבות עם נקבת C57BL / 6N, קולות קוליים היו בתדירות שיא נמוכה בהשוואת שיחות שנרשמו במהלך האינטראקציות המעורבות להמלטת wild-type שלהם (איור 4). בנוסף, הפרוטוקול הנוכחי מותר גם ללמוד בהקשר של פליטה של קולות קוליים על ידי שילוב של הנתונים מתוך הקלטות שמעו על הנתונים התנהגותיים מופקים MiceProfiler (תוכנה קפוא, עבר Institut eur, פריז). למשל, באינטראקציות נקבה-נקבה, רוב הקולות קוליים נפלטו כשבעלי חיים היו במגע או לייתר דיוק הכובש מרחרח באזור ano באיברי המין של-הפינה החדשה, או לפחות כובש להיות מאחורי-הפינה החדשה. גם הנפלטים עכברים רבים קולות קוליים כאשר הדייר התקרב-הפינה החדשה (איור 5, פנל עליון). פחות קולות נרשמו כאשר דייר Shank2 – / – העכברים היו במגע פיזי עם-הפינה החדשה (למשל, מרחרח באזור ano באיברי המין של-הפינה החדשה) מאשר כאשר היה כובש עכבר wild-type. פחות קולות היו מופעלים כאשר הדייר מאחורי-הפינה החדשה היה Shank2 – / – עכבר מאשר כאשר הוא עכבר wild-type. קולות נוספים נרשמו גם כאשר-הפינה החדשה הייתה בשדה הראייה של העכבר הכובש, ועל אחת כמה וכמה סוגי הפרוע מאשר המוטציות (איור 5, פנל תחתון). <p clas s = "jove_content" FO: keep-together.within-page = "1"> איור 2:. שיעור פליטת קולות קולי במהלך הפיתוח ב זכר בוגר ו Shank2 נקבה – / – עכברים להמלטה wild-type התקשר שיעור גורים (כל יומיים מ P2 ל P12, n = 18-19 Shank2 + / +, n = 15-16 Shank2 – / -) ומבוגרים במהלך אינטראקציות בין הזכר לנקבה-ייחום (n = 15 Shank2 + / +, n = 16 Shank2 – / -) ואינטראקציות נקבה-נקבה (n = 15 Shank2 + / +, n = 13 Shank2 – / -) ב עכברי-בר (פאנל משמאל) Shank2 – / – עכברים (פאנל מימין). הנתונים מוצגים כממוצע +/- SEM ו נקודות בודדות (לא לזווג ווילקוקסון בדיקות: * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001).ge.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 3:. רפרטואר קולי של Shank2 – / – עכברים להמלטת wild-type הפרופורציות של חמשת סוגי השיחות השונים הנפלטים על ידי גורי P2 (א '; n = 20 Shank2 + / +, n = 18 Shank2 – / -), גורי P6 (B, n = 19 Shank2 + / +, n = 18 Shank2 – / -), גורים P10 (C; n = 20 Shank2 + / +, n = 18 Shank2 – / -), זכרים בוגרים עם נקבה ייחום (D הנקבות) ומבוגרים עם נקבה אחרת (E n = 16 Shank2 + / +, n = 16 Shank2 – – /; n = 15 Shank2 + / +, n = 13 Shank2; </em> – / -) ב עכברי-בר (פאנלים משמאל) Shank2 – / – עכברים (לוחות מימין). הנתונים מוצגים כממוצע +/- SEM ו נקודות בודדות (בדיקות בריבוע צ'י: * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 4:. משתנה אקוסטיות מופקים קולות קולי Shank2 – / – עכברים להמלטת wild-type (א) משך כל סוגי השיחות נבוכים הנפלטת גורי P2 (n = 20 Shank2 + / +, n = 18 Shank2 – / – ), גורי P6 (n = 19 Shank2 + / +, n = 18 Shank2 – / -), גורי P10 (n = 20 Shank2 + / + </sעד>, n = 18 Shank2 – / -), זכרים בוגרים עם נקבה ייחום (n = 16 Shank2 + / +, n = 16 Shank2 – / -) ו נשים בוגרות עם נקבה אחרת (n = 15 Shank2 + / +, n = 13 Shank2 – / -) ב עכברי-בר (פאנל משמאל) Shank2 – / – עכברים (פאנל מימין). (ב) תדירות שיא מרבית נמדדה על כל סוגי השיחות מבולבלות גורי P2, גורי P6, גורי P10, זכרים בוגרים עם נקבת ייחום ונקבה בוגרת עם נקבה אחרת (באותו Ns כנ"ל). הנתונים מוצגים כממוצע +/- SEM ו נקודות בודדות (לא לזווג ווילקוקסון בדיקות: * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 5: קשר. הים של פליטה של קולות קולי עכבר באינטראקציות מבוגר חברתי נשי-נקבת שיעור של קולות קוליים הנפלט זוגות המעורבים Shank2 + / + עם עכבר C57BL / 6N (n = 16, א) ו זוגות המעורבים Shank2 – / – עם עכבר C57BL / 6N (n = 13, B) במהלך מהסוגים הבאים של אירועים התנהגותיים (אדום: הכובש, ירוק: חדש-פינה): קשרים חברתיים, oro-אוראלי קשר, ano באיברי המין וריחרחח העכבר הכובש, ano- איברי המין וריחרחח בעכבר החדש-הפינה, כובש מאחורי פינה חדשה, חדשה-פינה מאחורי הכובש, חוסר תנועה של כובש, חוסר תנועה של-פינה חדשה, גישה מן הכובש & לברוח מן-הפינה החדשה, גישה מהזווית-החדשה & להימלט מן הכובש, הגישה & לברוח מן הכובש, הגישה & לברוח מן-הפינה החדשה, כובש בעקבות-הפינה החדשה החדשה-הפינה, בתחום החזון של דייר, דייר בתחום החזון-הפינה חדשה. נתונים הם pכמו התרעם ממוצע +/- SEM ו נקודות בודדות (לזווג הלא בדיקות ווילקוקסון: * p <0.05, ** p <0.01). נתונים שלא פורסמו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. סוגי שיחות תיאור קצר משך ≤5 msec ותדירות טווח ≤6.25 kHz פָּשׁוּט משך> 5 msec ו kHz תדר בתחום ≤6.25 (שטוח), או אפנון תדר בכיוון אחד בלבד (כלפי מעלה או כלפי מטה) עם> טווח התדרים 6.25 קילוהרץ מורכב מודולציות תדירות בלמעלה מ> טווח כיוון תדר אחד 6.25 קילוהרץ (מווסת), או הכללת ג תדר אחד או יותר נוסףomponent (תופעות הרמוניות או שאינו ליניארי, אך לא רווי) אבל שום מגבלה על תווך (מורכב) קפיצות תדר הכללת קפיצה אחת (קפיצת תדר אחד) או קפיצות יותר (תדר קופץ, ואחרים) בתדירות ללא פער זמן בין רכיבי תדר ברציפות, עם (מעורב) או ללא כל חלק רועש בתוך שיחת הצליל הטהורה לא מובן לא ניתן לזיהוי מרכיב טהור טון; "רועשות" שיחות טבלה 1:. מאפייני חמישה סוגים של קולות קולי עכבר דוגמאות הקריטריונים של משך, עוצמת תדרים, מודולציות תדירות קפיצות תדרים שבשימוש כדי לקבוע 5 סוגי שיחות שונים בתוך קולות קולי עכבר.

Discussion

הפרוטוקול המובא כאן מספק דרכים סטנדרטיות ואמינות לאסוף קולות קולי עכבר במעבדה. במצבים מאוד מוגבלים אלה מרחיבים את היתרון של סטנדרטיזציה. הם משמשים בהצלחה להשוות זנים או גנוטיפים בתוך זני 18,19,26,27. כמוצג בתוצאות נציג, שיטות אלה מאפשרים זיהוי של תקשורת חברתית טיפוסיות בעכברים מוטציה עבור Shank2, גן הקשור הפרעות הספקטרום האוטיסטי. השוואות בין זני עכבר, בין הקשרים שונים או אפילו בין מעבדות תהיינה להיות מופעלות על ידי הזמינות של מערכי נתונים גדולים על מסד נתוני mouseTube. כלי זה אמור להגביר מחקרים על קולות קולי עכבר בכך שהוא מאפשר ניתוחים רבים משתנים.

הפרוטוקולים המתוארים כאן מותאמים לבדוק עכברים של גנוטיפים שונים בתוך זן, כפי שהדבר נעשה ברוב מחקרי דוגמנות ג הגנטיתontribution להפרעות נוירו-פסיכיאטריות. מומלץ באופן ניסיוני לעצב כל מחקר יש הבקרות הטובות ביותר האפשריות. ואכן, תופעות המלטה עלולות להסוות או לנפח באופן מלאכותי את השפעות גנטיות 28,29. לכן מומלץ לכלול שולטת להמלטה עבור כל גנוטיפ. רביית הורים הטרוזיגוטיים ולכן צריכים להיות מועדפים, שכן הוא יאפשר את ההתאמה הנכונה של עכברים שעברו מוטציה ושליטה בתוך חול. זה מצדיק את הקעקוע כפה סימון של כל הגורים (מסונוורים גנוטיפ) כדי לעקוב אחר אנשים ברחבי הקלטות כל יומיים. Genotyping נעשית גמילה, על ידי לקיחת דגימות זנב. במהלך הקלטת שיחות בידוד גור מ P2, אנחנו לא היינו ממליצים לקחת דגימות זנב כבר גורים, מאז המבצע הזה כולל מניפולציה משלימה ומתח קרוב מאוד בזמן הקלטות.

הפרוטוקולים הציעו כאן כדי לעורר קולות קוליים במבוגרים אינו מאפשרים זיהוי ברור של EMItter של קולות. זה מסביר מדוע אנו לתפעל את המוטיבציה של חית הבדיקה. אכן, עכברי המבחן מבודדים ולא-הפינה החדשה וחי המבחן להרגיל במשך זמן רב לכלוב הבדיקה במהלך אינטראקציות בין בני אותו מין. באינטראקציות בין גברים לנשים, הנקבה הציגה אינה מבודדת וזכר המבחן מתרגל עבור זמן קצר מאז מוטיבציה עשויה להיות גבוהה בהקשר מיני. מניפולציות אלה מוטיבציה צריכות למקסם את ההסתברות של עכבר מבחן פולטות הקולות ולא אחד הציג. כדי להקליט קולות קולים זכרו בהקשר מיני, מקלון צמר גפן פשוט עם טרי (כלומר, לא קפוא) שתן של אשת ייחום ניתן להכניס גם בכלוב 30. שיטה זו מאפשרת ההקצאה של קולות קוליים כדי זכר הבדיקה עם 100% ודאות אך הוא מונע איסוף מידע ספציפי על ההקשר החברתי בפועל של פליטה של ​​קולות אלה. לכן, אנו מעדיפים את protocol המתואר כאן (עם נקבת ייחום בחופשיות-נע). כמו כן, אנו ממליצים תמיד להשתמש בעכברים הציגו מאותו הזן כאשר בודקים עכברים מן זן מוטנטי ולנתח את הנתונים כמו זוג עכברים וקולות ברובם. אחד המחקרים האחרונים מקדם את השימוש טריאנגולציה למקם את פולט 31. במחקר זה, נמצאו נקבות לפלוט גם קולות קוליים במהלך מפגשים עם זכר. זה עשוי להיות מוסבר על ידי העובדה כי הם בודדו במשך שבועיים לפחות לפני ההקלטות. ההכללה של שימוש הטריאנגולציה מוצעת במחקר זה יש בכל זאת לאפשר זיהוי של הפולט של הקולות במקרים ביותר אם הקלטות וידאו מסונכרנות כראוי.

הקריאות במנותק מן הגורים שנרשמו במהלך פיתוח לא מופרעות ע"י רעש רקע מן המצעים. בדרך כלל ניתוח אוטומטי עובד טוב מאוד כדי לחלץ את המשתנים העיקריים. לעומת זאת, קולות רשמו ממבוגרים הם דisturbed ידי רעשי רקע מבעלי החיים נעים המצעים. ניתוח אוטומטי עשוי להיכשל, ולכן יש להשתמש ניתוח הוראות. אף על פי כן, הוספת מצעים בכלוב המבחן צריכה לספק תנאים שהם פחות מלחיצים עבור בעלי החיים מאשר קרקע חשופה (שעכברים לא אוהבים). מאמצים נוספים בקהילה מרוכזות על שיפור זיהוי האוטומטי של קולות קוליים בתנאים שונים, גם אלה רעשי רקע רומזים. לדוגמה, התוכנה Voice מאפשרת לנתח קולות כי נבחרו באופן ידני על היעדרו של רעשי רקע 32. תוכנה זו, החילוץ של משתני אקוסטית הוא אוטומטית אבל צריך הבחירה הידנית הראשונית.

יצוין כי ההשתנות בין הפרט חשובה מאוד בהתנהגות הקול של עכברים. למשל, קצב השיחה של זכרים בוגרים בנוכחות נקבת ייחום מופץ מאוד (איור 1). אנחנו suggest פרוטוקולים הסטנדרטיים אלה כדי לעורר קולות קוליים כבר להגביל את ההשתנות הקשורות בהקשר הניסיון. עם זאת, ברצוננו להצביע על החשיבות של הצגה לא רק את הממוצע ואת SEM עבור הנתונים, אבל הכי חשוב נקודות הפרט בדגימות של גודל קטן 33. זה גם מאוד רלוונטי – אם לא הכרחי – לרשום לפחות 12 אנשים של כל קבוצה / גנוטיפ לאסוף נתונים נציג. במקרים רבים, ההשתנות הבינה-האדם לא צריכה להיות מוסתרת (בדרך כלל זה לא יכול להיות), וזה עלול להיות בעל חשיבות גבוהה לזהות אנשים הנושאים את המוטציה הגנטית למדה אבל לא הציג שום פנוטיפ טיפוסית. אנשים כאלה יכולים לספק רמזים לגבי פיצויים, אשר עשוי לפתוח נתיבים חדשים עבור טיפולים של הפרעות גנטיות.

ברוב האפיונים התנהגותיים של מודלי עכבר להפרעות נוירו-פסיכיאטריות, התנהגות קול וקשרים חברתיים הם רואיםאד זה מזה (למשל, 19,27,34,35). שיטות מחקר שבוצע לאחרונה החברה לספק אפיון מפורט חצי אוטומטי של אירועים חברתיים רצפים של אירועים במהלך אינטראקציה (באמצעות MiceProfiler למשל) 36, כמו גם את האפשרות לשלב ניתוח זה עם נתוני הקלטות שמע. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא לספק תמונה מקיפה של התקשורת החברתית בעכברי מודל של ASD, כדי לייתר דיוק לזהות אילו היבטים של תקשורת החברתית מושפעים. בפרוטוקול הנוכחי הסנכרון עדיין ידני אבל זה יכול להיות משופר על ידי מפעיל את הקלטת וידאו באמצעות תוכנת הקלטת שמע. סוג זה של ניתוחים צריך להיות הסטנדרט לספק תמונה מקיפה יותר של גירעונות תקשורת חברתית בעכברי מודל של הפרעות נוירופסיכיאטריות. בנוסף, עד עכשיו, אותות קול מנותחים בעיקר מהצד הפולט (כלומר, בדיקות בנויות להעדיף פליטת voאותות קאל על ידי העכבר נבדק, כמו בפרוטוקולים הנוכחיים). ההתמקדות צריכה עכשיו גם להיות מוגדר על מקבל אותות אלה, כדי לזהות טוב יותר את הפונקציות של אותות אקוסטיים אלה. זה צריך להיעשות על ידי ההערכה גם את ההתנהגות של העכברים-הפינה החדשה בפרוטוקולים הנוכחיים במבוגרים (באמצעות MiceProfiler למשל) 36, באמצעות ניסויי השמעה 16, או על ידי הגדרת פרוטוקולים חדשים. אכן, הפרוטוקולים הנוכחיים לספק מצבים מוגבלים מאוד כי אולי לא משקפים את תנאי האתולוגי המדויקים של פליטת ניקוד בעכברים. הפליטה הספונטנית של קולות קוליים תצטרך להיות מאופיינת יותר באמצעות הקלטות וידאו ושמע רציפות לשפוך אור נוסף על ההתנהגות ווקאלית הספונטנית של עכברים.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Fondation de France; by the ANR FLEXNEURIM [ANR09BLAN034003]; by the ANR [ANR- 08-MNPS-037-01-SynGen]; by Neuron-ERANET (EUHF-AUTISM); by the Fondation Orange; by the Fondation FondaMentale; by the Fondation de France; by the Fondation Bettencourt-Schueller. The research leading to this article has also received support from the Innovative Medicine Initiative Joint Undertaking under grant agreement no. 115300, resources of which are composed of financial contribution from the European Union’s Seventh Framework Program (FP7/2007-2013) and EFPIA companies’ in kind contribution. We thank Julie Lévi-Strauss for helpful comments on the manuscript and six anonymous reviewers whose comments noticeably improved the manuscript.

Materials

needles 0.3 x 13 mm [30G 1/2"]  BD Microlance 304000 –
green tattoo paste Ketchum Manufacturing Inc., Ottawa, Canada 329AA –
thermometer Fisherbrand, Waltham, USA 4126 (W255NA) –
self-made soundproof chamber (pups) Institut Pasteur, Paris – acoustic foam + plexiglas; inside dimensions (W x H x D): 32 x 33 x 32 cm
small surface thermister + single probe thermocouple Harvard Apparatus 599814 + 601956 –
smell-less pen for instance: Giotto – ink made with water, washable: these pens are designed for babies
Ethanol absolute (100%) Sigma Aldrich,  Saint-Quentin Fallavier, France 24103 diluted 1/10
Condenser ultrasound microphone Avisoft-Bioacoustics CM16/CMPA Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany #40011 furnished with extension cables by the Avisoft company
Ultrasound Gate 416H Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany #34163 sound card
Avisoft Recorder USGH Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany #10301; #10302 recording software for Windows Vista, 7 and 8
Avisoft SASLab Pro Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany #10101, 10111; #10102, 10112;  Windows 10, 8.1, 8, 7 or Vista including Intel-based Apple Macintosh running Boot Camp, Parallels or similar virtualization software.
Laptop or Apple Macintosh running Boot Camp – – running Windows 10, 8.1, 8, 7 or Vista; for the Apple Macintosh, Boot Camp is preferred to virtualizations softwares such as Parallels due to memory constraints
plastic recipient (pup recordings) Lock & Lock, Chatswood, USA HPL932D Lock & Lock Stackable Airtight Container Round 700ml; use without the cover; dimensions: 9 cm diameter, 10 cm height
PBS 1X (pH=7.4) Gibco (Life Technologies) 10010-023 –
slides Menzel-Gläser, Thermo Scientific J1800AMNZ Superfrost Plus
May-Grünwald solution 500 ml RAL Réactifs, Martillac, France 320070-0500 –
Giemsa R 500 ml RAL Réactifs, Martillac, France 720-1107 diluted 1/20 in phosphate buffer solution
phosphate buffer solution (self-made) – – pH=7, 0.1 M: 39 ml NaH2PO4 0.2 M + 61 ml Na2HPO4 0.2 M + 100 ml H2O (final volume: 200 ml)
test cage Institut Pasteur, Paris – 50 x 25 cm, 30 cm height; Plexiglas
self-made soundproof chamber (adult recordings) Institut Pasteur, Paris – acoustic foam + PVC; inside dimensions (W x H x D): 66 x 90 x 46 cm
video camera From Noldus Information Technologies, Wageningen, The Netherlands – high-resolution CamTech Super-Hi-Res video camera; 25 fps 
EthoVision XT Noldus Information Technology, Wageningen, The Netherlands http://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/ethovision-xt video acquisition software
Mice Profiler Tracker plugin from the ICY platform Bio Image Analysis, Institut Pasteur, Paris http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Mice_Profiler_Tracker tracking software to analyse behavioral events during social interactions
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. American Psychiatric Association. . , (2013).
  2. Ey, E., Leblond, C. S., Bourgeron, T. Behavioral Profiles of Mouse Models for Autism Spectrum Disorders. Autism Res. 4 (1), 5-16 (2011).
  3. Bourgeron, T., Jamain, S., Granon, S. Animal Models of Autism – Proposed Behavioral Paradigms and Biological Studies. Contemporary Clinical Neuroscience: Transgenic and Knockout Models of Neuropsychiatric Disorders. , 151-174 (2006).
  4. Scattoni, M. L., Crawley, J., Ricceri, L. Ultrasonic vocalizations: A tool for behavioural phenotyping of mouse models of neurodevelopmental disorders. Neurosci. Biobehav. Rev. 33 (4), 508-515 (2009).
  5. Portfors, C. V., Perkel, D. J. The role of ultrasonic vocalizations in mouse communication. Cur. Opin. Neurobiol. 28, 115-120 (2014).
  6. Arriaga, G., Zhou, E. P., Jarvis, E. D. Of mice, birds, and men: the mouse ultrasonic song system has some features similar to humans and song-learning birds. PLOS ONE. 7, e46610 (2012).
  7. Hammerschmidt, K., Schreiweis, C., Minge, C., Pääbo, S., Fischer, J., Enard, W. A humanized version of Foxp2 does not affect ultrasonic vocalization in adult mice: Ultrasonic vocalization of "humanized" FoxP2 mice. Genes Brain Behav. , (2015).
  8. Portfors, C. V. Types and functions of ultrasonic vocalizations in laboratory rats and mice. J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 46, 28-34 (2007).
  9. Panksepp, J. B., et al. Affiliative Behavior, Ultrasonic Communication and Social Reward Are Influenced by Genetic Variation in Adolescent Mice. PLOS ONE. 2, (2007).
  10. Zippelius, H. -. M., Schleidt, W. M. Ultraschall-Laute bei jungen Mäusen. Naturwissenschaften. 43, 502 (1956).
  11. Whitney, G., Coble, J. R., Stockton, M. D., Tilson, E. F. Ultrasonic emissions: do they facilitate courtship of mice. J. Comp. Physiol. Psychol. 84, 445-452 (1973).
  12. Holy, T. E., Guo, Z. S. Ultrasonic songs of male mice. PLOS Biol. 3, 2177-2186 (2005).
  13. Maggio, J. C., Whitney, G. Ultrasonic vocalizing by adult female mice (Mus musculus). J. Comp. Psychol. 99, 420-436 (1985).
  14. Chabout, J., et al. Adult Male Mice Emit Context-Specific Ultrasonic Vocalizations That Are Modulated by Prior Isolation or Group Rearing Environment. PLOS ONE. 7 (1), e29401 (2012).
  15. Hammerschmidt, K., Radyushkin, K., Ehrenreich, H., Fischer, J. Female mice respond to male ultrasonic "songs" with approach behaviour. Biol. Lett. 5, 589-592 (2009).
  16. Wöhr, M., Moles, A., Schwarting, R. K. W., D’Amato, F. R. Lack of social exploratory activation in male -opioid receptor KO mice in response to playback of female ultrasonic vocalizations. Soc. Neurosci. 6, 76-87 (2011).
  17. Granon, S., Faure, P., Changeux, J. -. P. Executive and social behaviors under nicotinic receptor regulation. Proc. Nat. Acad. Sci. 100 (16), 9596-9601 (2003).
  18. Schmeisser, M. J., et al. Autistic-like behaviours and hyperactivity in mice lacking ProSAP1/Shank2. Nature. 486 (7402), 256-260 (2012).
  19. Ey, E., et al. Absence of Deficits in Social Behaviors and Ultrasonic Vocalizations in Later Generations of Mice Lacking Neuroligin4. Genes Brain Behav. 11, 928-941 (2012).
  20. Chadman, K. K., et al. Minimal Aberrant Behavioral Phenotypes of Neuroligin-3 R451C Knockin Mice. Autism Res. 1, 147-158 (2008).
  21. Scattoni, M. L., Gandhy, S. U., Ricceri, L., Crawley, J. N. Unusual Repertoire of Vocalizations in the BTBR T plus tf/J Mouse Model of Autism. PLOS ONE. 3, (2008).
  22. De Chaumont, F., Coura, R. D. -. S., et al. Computerized video analysis of social interactions in mice. Nat. Methods. 9, 410-417 (2012).
  23. Leblond, C. S., et al. Genetic and Functional Analyses of SHANK2 Mutations Suggest a Multiple Hit Model of Autism Spectrum Disorders. PLOS Genet. 8 (2), e1002521 (2012).
  24. Berkel, S., et al. Mutations in the SHANK2 synaptic scaffolding gene in autism spectrum disorder and mental retardation. Nat. Genet. 42, 489-491 (2010).
  25. Pinto, D., et al. Functional impact of global rare copy number variation in autism spectrum disorders. Nature. 466, 368-372 (2010).
  26. Ey, E., et al. The autism ProSAP1/Shank2 mouse model displays quantitative and structural abnormalities in ultrasonic vocalisations. Behav. Brain Res. 256, 677-689 (2013).
  27. Scattoni, M. L., Ricceri, L., Crawley, J. N. Unusual repertoire of vocalizations in adult BTBR T plus tf/J mice during three types of social encounters. Genes Brain Behav. 10, 44-56 (2010).
  28. Zorrilla, E. P. Multiparous species present problems (and possibilities) to developmentalists. Dev. Psychobiol. 30 (2), 141-150 (1997).
  29. Lazic, S. E., Essioux, L. Improving basic and translational science by accounting for litter-to-litter variation in animal models. BMC Neurosci. 14 (1), 37 (2013).
  30. Hoffmann, F., Musolf, K., Penn, D. J. Freezing urine reduces its efficacy for eliciting ultrasonic vocalizations from male mice. Physiol. Behav. 96, 602-605 (2009).
  31. Neunuebel, J. P., Taylor, A. L., Arthur, B. J., Egnor, S. R. Female mice ultrasonically interact with males during courtship displays. eLife. 4, (2015).
  32. Burkett, Z. D., Day, N. F., Peñagarikano, O., Geschwind, D. H., White, S. A. VoICE: A semi-automated pipeline for standardizing vocal analysis across models. Sci. Rep. 5, 10237 (2015).
  33. Weissgerber, T. L., Milic, N. M., Winham, S. J., Garovic, V. D. Beyond Bar and Line Graphs: Time for a New Data Presentation Paradigm. PLOS Biol. 13 (4), e1002128 (2015).
  34. Jamain, S., et al. Reduced social interaction and ultrasonic communication in a mouse model of monogenic heritable autism. Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. A. 105, 1710-1715 (2008).
  35. Won, H., et al. Autistic-like social behaviour in Shank2-mutant mice improved by restoring NMDA receptor function. Nature. 486, 261-265 (2012).
  36. Ferhat, A. -. T., Le Sourd, A. -. M., de Chaumont, F., Olivo-Marin, J. -. C., Bourgeron, T., Ey, E. Social Communication in Mice – Are There Optimal Cage Conditions?. PLOS ONE. 10 (3), e0121802 (2015).

Tags

MouseUltrasonic VocalizationsSocial CommunicationAutismNeuroscienceMouse ModelRecordingMicrophoneTemperaturePupAdultPlexiglas CageSoundproof BoxData Collection

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Ferhat, A., Torquet, N., Le Sourd, A., de Chaumont, F., Olivo-Marin, J., Faure, P., Bourgeron, T., Ey, E. Recording Mouse Ultrasonic Vocalizations to Evaluate Social Communication. J. Vis. Exp. (112), e53871, doi:10.3791/53871 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image