A transferência de genes para o frango auditivo órgão por<em> In Ovo</em> Micro-eletroporação

Apesar das diferenças na morfologia e padronização celular entre os mamíferos e órgão sensorial auditiva aviária, os fatores moleculares e vias responsáveis ​​pelo desenvolvimento HC sensorial são pensados ​​para ser evolutivamente conservada ^1-3. A papila basilar, que abriga os HCs auditivas e suas SCs circundantes, se desenvolve como um outpocketing do otocyst ouvido interno. Logo no início de uma piscina de progenitores HC e SC é especificado dentro do plac�io ótica ótica domínio / copo neural-sensorial competente (NSD). Dados destino de mapeamento de fornecer evidências de que linhagens neuronais e sensoriais são ligados e surgem da NSD localizada na região antero-ventral do copo ótica ou otocyst em ratos e galinhas ^4,5. Em primeiro lugar, neuroblasts delaminate da NSD para dar origem aos neurônios do gânglio auditivo-vestibular, o que acabou dividida em gânglios auditivo e vestibular. Esses neurônios inervam os HCs sensoriais do ouvido interno e núcleos no tronco cerebral. As células Them permanecer no NSD são pensados ​​para dar origem a várias manchas sensoriais, incluindo o órgão auditivo sensorial, que consiste em os HCs sensoriais de transdução mecano e seus SCs associados.

Em ambos os pintos e murino, órgão auditivo progenitor sensorial saída do ciclo celular e diferenciação HC ocorrer em gradientes opostos. Em pintinho, progenitor auditiva saída do ciclo celular começa em torno de ~ E5 e progride a partir da base para o ápice, e do centro para a periferia ^6. Um dia mais tarde, começa HC diferenciação no vértice e progride para a base ^7. Estudando o desenvolvimento do ouvido interno em frango proporciona muitas vantagens técnicas como mecanismos funcionais podem ser investigadas com relativa facilidade in ovo em oposição a manipulação de embriões no útero, em outros sistemas de modelos, que requer cirurgias complexas. O método descrito aqui utiliza in ovo micro-electroporação de genes alvo de interesse no Basila presuntivoárea de papila r ântero-ventral na vesícula ótica especificamente a E4.

A electroporação in ovo é uma técnica que está bem estabelecida e utilizada ^8-14. O princípio da técnica de electroporação, é baseado no facto de nucleótidos (por exemplo, ADN de plasmídeo, DNA sintético, RNA ou oligonucleótidos) são carregadas negativamente. O ADN é injectada no tecido de interesse. Quando uma corrente eléctrica é colocada ao longo do tecido, a actual abre poros transientes nas paredes das células e permite a captação do ADN, como flui do ADN carregado negativamente em direcção ao eléctrodo positivo (ânodo). Para as experiências de ganho-de-função, os genes de interesse são subclonados em vulgarmente plasmídeos de expressão que contêm cassetes de expressão adequados para a proteína verde fluorescente (GFP) ou a proteína fluorescente vermelha (RFP). Para as experiências de construções de perda de função com base em plasmídeos dominantes negativos repressores, ou RNAi, ou construções morfolino são commonly usado ^15,16. Para inibir microARN (miARN) função miARNs construções de esponja, que são tipicamente plasmídeo com base, pode ser usado ^17. O método aqui descrito permite investigar os mecanismos moleculares que controlam a proliferação e diferenciação no órgão auditivo, em que o método de micro-electroporação in ovo pode ser facilmente combinado com no ensaio de proliferação celular in ovo adicionando EdU a todo o embrião.

A electroporação e a adição de EdU é realizada em E4 na vesícula ótica, que é um dia antes do início da saída do ciclo celular no órgão auditivo. Análise do órgão auditivo é tipicamente realizada 18-96 horas após a electroporação em E5 (aparecimento de células progenitoras saída sensorial do ciclo celular), E6 (início da diferenciação HC), e E7 (durante a diferenciação HC); e mais tarde até ~ E9 (fim da diferenciação HC). Este método de electroporação de transferência de genes é transitória que dura aproximadamente 4 dias ~, because os genes de interesse não se integram no genoma, mas o método é aplicável para utilização com vectores de expressão à base de ADN de plasmídeo apropriado, que têm a capacidade de integrar no genoma, tal como a transferência de genes mediada ^Tol2-11. Com este método GFP robustos ou expressão RFP dura ~ 4 dias na cóclea, após o que apontam os sinais desaparecem, mas fornecem uma janela de tempo suficiente para estudar o desenvolvimento intrincado do órgão auditivo. Este, por método de transferência de genes in ovo é novo e permite que visar especificamente o órgão auditivo presuntivo em E4, que é ideal para as investigações que incidem sobre o desenvolvimento HC no órgão auditivo. É um bom complemento para métodos alternativos, que electroporate em muito mais jovens estágios de desenvolvimento ^11,12 ou em comparação com o uso de in vitro papilas basilar de explantes culturas ^18.