チキン聴覚器官への遺伝子導入によって、<em>卵内</em>マイクロエレクト​​ロポレーション

哺乳類や鳥類の聴覚感覚器官との間の形態や細胞パターニングの違いにもかかわらず、感覚HCの開発を担当した分子の要因と経路は、進化的に^1-3で保存していると考えられています。聴覚のHCとその周辺のSCを収容する基底乳頭は、内耳の耳胞のoutpocketingとして開発しています。初期のHCとSC前駆細胞のプールには、耳プラコード/耳のカップ神経感覚有能なドメイン（NSD）内に指定されています。フェイト・マッピングデータは、神経や感覚系統がリンクされていることの証拠を提供し、マウスやニワトリの^4,5で耳のカップや耳胞の前-腹側領域に位置NSDから生じます。まず、神経芽細胞は、最終的には聴覚と前庭神経節に分割聴覚・前庭神経節の神経細胞を生じさせるためにNSDから剥離し。これらのニューロンは、脳幹における内耳および核の感覚のHCを支配します。細胞番目NSDに残るでメカノ伝達感覚のHCおよびその関連のSCからなる、聴覚感覚器官を含む様々な感覚パッチを生じると考えられています。

ひよことマウスの両方で、聴覚器官感覚前駆細胞周期の出口とHCの分化は、対向する勾配で発生します。ひよこでは、聴覚前駆細胞周期の出口が〜E5の周りに始まり、頂点にベースから進行し、中心部から周辺部⁶へ。 1日後、HC分化が頂点に始まり、ベース⁷に進みます。複雑な手術を必要とする、他のモデル系に子宮内で胚を操作するとは対照的に、機能的なメカニズムが卵内で比較的容易に調べることができるように鶏における内耳の開発を研究することは、多くの技術的な利点を提供します。ここで説明する方法は、推定basilaに目的の遺伝子を標的とするために、卵のマイクロエレクトロポレーションに使用しています特にE4で耳胞で前方 – 腹側R乳頭エリア。

卵内エレクトロポレーションは十分に確立され、一般的に^8月14日に使用されている技術です。エレクトロポレーション技術の原理は、ヌクレオチド（ 例えば、プラスミドDNA、合成DNA、またはRNAオリゴヌクレオチド）、負に帯電しているという事実に基づいています。 DNAは、目的の組織に注入されます。電流が組織を横切って配置されると、電流は、細胞壁に過渡毛穴を開き、負に帯電したDNAは、正極（陽極）に向かって流れるように、DNAの取り込みを可能にします。機能獲得型実験のために、目的の遺伝子は、一般的に緑色蛍光タンパク質（GFP）または赤色蛍光タンパク質（RFP）のために適切な発現カセットを含む発現プラスミドにサブクローニングします。機能喪失実験のために、プラスミドベースのドミナントネガティブリプレッサー構築物またはRNAi、またはモルホリノ構築物は、cはommonly ^15,16を使用^していました。ベースのプラスミド、典型的には、マイクロRNA（miRNAの）機能のmiRNAスポンジ構造を、抑制するために^、17を使用することができます。 卵マイクロエレクトロポレーション法で容易に全胚にEDUを添加することによって卵細胞増殖アッセイ中で組み合わせることができ、ここで説明する方法は、聴覚器官に増殖および分化を制御する分子機構を調査することを可能にします。

エレクトロポレーションおよびEDUの添加は、一日の聴覚器官における細胞周期の出口の開始前である耳胞でE4で行われます。聴覚器官の分析は、典型的には18行う – E5（感覚前駆細胞周期の出口の開始）、E6（HC分化の開始）、及び（HC分化中）E7でエレクトロポレーション後96時間に、以降〜E9（HC分化の終わり）まで。遺伝子導入のこのエレクトロポレーション法は、約3〜4日間持続する一過性であるbecauSEは、目的の遺伝子がゲノムに統合されませんが、この方法は、このようなTol2の媒介遺伝子導入¹¹として、ゲノムに統合する能力を持っている適当なプラスミドDNAベースの発現ベクターでの使用にも適用可能です。この方法堅牢なGFPまたはRFP発現と、蝸牛に〜4日間持続する信号は、フェード、その時点の後、まだ聴覚器官の複雑な発達を研究するための十分な時間窓を提供します。 卵内遺伝子導入法ではこれは新規であり、特に聴覚器官にHCの開発に注力調査のために最適であるE4で推定聴覚器官を、ターゲットとすることができます。それは^、11,12またはin vitroでの脳底乳頭の外植片培養¹⁸の使用に比べ、はるかに年下の発達段階をエレクトロポレーションの代替方法、に優れた付加です。