Gene Transfer nel pollo Auditory Organ<em> In Ovo</em> Micro-elettroporazione

Nonostante le differenze nella morfologia e patterning cellulare tra mammiferi e aviaria organo sensoriale uditivo, i fattori molecolari e dei percorsi responsabili dello sviluppo HC sensoriali sono pensati per essere evolutivamente conservato ^1-3. La papilla basilare, che ospita le HC uditive e le loro SC circostanti, si sviluppa come un outpocketing del otocyst dell'orecchio interno. Nella fase iniziale di un pool di progenitori HC e SC è specificato all'interno del / otic dominio competente tazza neurale-sensoriale otic placode (NSD). Fate dati di mappatura dimostrano che lignaggi neuronali e sensoriali sono collegati e nascono dalla NSD situato nella regione antero-ventrale della coppa otic o otocyst nei topi e pollo ^4,5. In primo luogo, neuroblasti delaminano dal NSD per dare origine ai neuroni del ganglio uditivo-vestibolare, che alla fine diviso in gangli uditivo e vestibolare. Questi neuroni innervano i HC sensoriali dell'orecchio interno e nuclei del tronco cerebrale. Le cellule Tha rimanere nel NSD si pensa di dare origine a varie patch sensoriali, tra cui l'organo sensoriale uditivo, costituito dai HC sensoriali meccano-trasduzione e le loro SC associati.

In entrambi il pulcino e murino, organo uditivo progenitrice sensoriale uscita del ciclo cellulare e la differenziazione HC si verificano in opposte gradienti. In pulcino, uditivo progenitrice uscita del ciclo cellulare inizia intorno ~ E5 e progredisce dalla base all'apice, e dal centro alla periferia ^6. Il giorno dopo, la differenziazione HC inizia nel vertice e progredisce alla base ^7. Studiando lo sviluppo dell'orecchio interno nei polli offre molti vantaggi tecnici meccanismi funzionali possono essere studiate con relativa facilità in ovo al contrario di manipolare embrioni in utero in altri sistemi modello, che richiede interventi complessi. Il metodo descritto qui utilizza in ovo micro-elettroporazione per indirizzare i geni di interesse nella Basila presuntivaR zona della papilla antero-ventrale nella vescicola otica specificamente a E4.

Elettroporazione in ovo è una tecnica che è ben consolidata e comunemente usato ^8-14. Il principio della tecnica elettroporazione si basa sul fatto che i nucleotidi (ad esempio, DNA plasmidico, DNA sintetico, o RNA oligonucleotidi) sono caricati negativamente. Il DNA viene iniettato nel tessuto di interesse. Quando una corrente elettrica viene inserito attraverso il tessuto, la corrente si apre pori transitori nelle pareti cellulari e permette l'assorbimento del DNA, come il DNA caricato negativamente fluisce verso l'elettrodo positivo (anodo). Per gli esperimenti di guadagno di funzione, i geni di interesse sono comunemente subclonati in plasmidi di espressione che contengono adeguate cassette di espressione per Green Fluorescent Protein (GFP) o proteina fluorescente rossa (RFP). Per la perdita di funzione esperimenti plasmide-based dominanti costrutti negativi repressori, o RNAi, o costrutti morpholino sono commonly usato ^15,16. Per inibire microRNA (miRNA) funzione miRNA costrutti spugna, che sono tipicamente plasmide base, può essere utilizzato ^17. Il metodo qui descritto permette di indagare i meccanismi molecolari che controllano la proliferazione e la differenziazione nell'organo uditivo, come nel metodo di micro-elettroporazione ovo possono essere facilmente combinati con in test di proliferazione cellulare ovo aggiungendo EdU a tutta dell'embrione.

L'elettroporazione e l'aggiunta di EdU viene eseguita a E4 nella vescicola otica, che è un giorno prima della comparsa di uscita del ciclo cellulare nell'organo uditivo. L'analisi dell'organo uditivo è in genere eseguita 18-96 ore dopo l'elettroporazione in E5 (insorgenza di uscita del ciclo cellulare progenitrici sensoriale), E6 (insorgenza di differenziazione HC), e E7 (durante la differenziazione HC); e poi fino a ~ E9 (fine differenziazione HC). Questo metodo elettroporazione del trasferimento genico è transitorio della durata di circa ~ 4 giorni, because i geni di interesse non si integrano nel genoma, ma il metodo è applicabile per l'uso con adeguato plasmide vettori di espressione basati sul DNA, che hanno la capacità di integrarsi nel genoma, come ad esempio il trasferimento genico mediato Tol2 ^11. Con questo metodo GFP robusto o espressione RFP dura ~ 4 giorni nella coclea, dopo che indicano i segnali di dissolvenza, ma forniscono una finestra di tempo sufficiente per studiare lo sviluppo intricato dell'organo uditivo. Questo metodo di trasferimento genico in ovo è nuovo e consente di indirizzare specificamente l'organo uditivo presuntiva in E4, che è ottimale per le indagini che si concentrano sullo sviluppo HC nell'organo uditivo. Si tratta di una buona aggiunta ai metodi alternativi, che l'elettroporazione in molto più giovani stadi di sviluppo o ^11,12 rispetto all'uso di in vitro basilare papille culture espianto ^18.