Gene Transfer naar de kip gehoororgaan door<em> In Ovo</em> Micro-elektroporatie

Ondanks verschillen in morfologie en cellulaire patroonvorming tussen de zoogdieren en vogels auditieve zintuig, worden de moleculaire factoren en routes die verantwoordelijk zijn voor de sensorische HC ontwikkeling gedacht evolutionair geconserveerd ^1-3. De basilaire papilla, die de auditieve HK's en hun omgeving SC huizen, ontwikkelt zich als een outpocketing van het binnenoor otocyst. Vroeg op een pool van HC en SC voorlopers wordt opgegeven binnen de otic placode / otic cup neurale-zintuiglijke bevoegde domein (NSD). Fate-kaartgegevens leveren het bewijs dat de neuronale en sensorische lijnen zijn met elkaar verbonden en komen voort uit de NSD in de antero-ventrale regio van de otic beker of otocyst bij muizen en kippen ^4,5. Eerst, neuroblasts delamineren van de NSD invloed kunnen uitoefenen neuronen van de auditieve-vestibulaire ganglion, die uiteindelijk verdeeld auditieve en vestibulaire ganglia geven. Deze neuronen innerveren sensorische HC van het binnenoor en kernen in de hersenstam. De cellen thten blijven in de NSD wordt gedacht dat ze ontstaan ​​verschillende sensorische patches, waaronder de auditieve zintuig geven, bestaande uit de in mechanisch sensorische transductie HK's en de bijbehorende SC.

In zowel het kuiken en muizen, gehoororgaan sensorisch voorlopercellen celcyclus exit en HC differentiatie komen in tegengestelde gradiënten. In kuiken, auditieve progenitor celcyclus exit begint rond ~ E5 en vordert van de basis naar de top en van het centrum naar de periferie ^6. Eén dag later, HC differentiatie begint de apex en zich ontwikkelt tot de basis ^7. Het bestuderen van de ontwikkeling van het binnenoor van kip heeft vele technische voordelen als functionele mechanismen kunnen worden onderzocht met relatief gemak in ovo tegenover manipuleren van embryo's in de baarmoeder in andere modelsystemen die complexe operaties vereist. De hier beschreven methode gebruikt in ovo micro-elektroporatie genen van belang richten in de vermoedelijke basilar papilla gebied anterior-ventraal in de otic blaasje specifiek op E4.

Elektroporatie in ovo is een techniek die goed ingeburgerd en veelgebruikte ^8-14. Het principe van de electroporatie techniek is gebaseerd op het feit dat nucleotiden (bijvoorbeeld plasmide-DNA, synthetisch DNA of RNA oligonucleotiden) negatief geladen zijn. Het DNA wordt geïnjecteerd in het weefsel van belang. Wanneer een elektrische stroom wordt geplaatst in het weefsel, de huidige opent tijdelijke poriën in de celwanden en maakt de opname van het DNA, als negatief geladen DNA stroomt naar de positieve elektrode (anode). Voor gain-of-function experimenten worden genen van belang gewoonlijk gekloneerd in expressieplasmiden die geschikt expressiecassettes voor groen fluorescerend eiwit (GFP) of rood fluorescerend eiwit (RFP) bevatten. Voor loss-of-function experimenten plasmide gebaseerde dominant negatief repressor constructen, of RNAi, of morfolino constructen commonly gebruikt ^15,16. Om microRNA (miRNA) functie miRNAs spons constructen, die typisch gebaseerd plasmide remmen, kan worden gebruikt ^17. De hier beschreven werkwijze maakt het onderzoeken van de moleculaire mechanismen die de proliferatie en differentiatie regelen in het auditieve orgaan, zoals de in ovo micro-elektroporatiewerkwijze gemakkelijk met in ovo celproliferatie assay kan worden gecombineerd door toevoeging EDE het hele embryo.

De elektroporatie en toevoeging van EDU wordt uitgevoerd bij E4 in het otische vesikel, één dag voor het begin van celcyclus exit in het auditieve orgaan. Analyse van het gehoororgaan is meestal uitgevoerd 18-96 uur na elektroporatie bij E5 (aanvang van zintuiglijke voorlopercellen celcyclus exit), E6 (begin van de HC differentiatie), en E7 (bij HC differentiatie); en later tot ~ E9 (einde van HC differentiatie). Dit elektroporatie methode van genoverdracht is van voorbijgaande aard blijvende ongeveer ~ 4 dagen, because de genen van belang niet integreren in het genoom, maar de methode is toepasbaar voor gebruik met geschikte plasmide-DNA-expressievectoren, die wel de mogelijkheid om te integreren in het genoom, zoals Tol2 gemedieerde genoverdracht ^11. Met deze methode robuuste GFP of RFP expressie duurt ~ 4 dagen in het slakkenhuis, waarna wijzen de signalen vervagen, maar toch zorgen voor een ruime tijd venster naar de ingewikkelde ontwikkeling van het gehoororgaan te bestuderen. Dit in ovo genoverdracht werkwijze is nieuw en maakt specifiek te richten de vermoedelijke gehoororgaan in E4, die optimaal is voor onderzoeken die gericht zijn op HC ontwikkeling in het auditieve orgaan. Het is een goede aanvulling op alternatieve werkwijzen die elektroporatie bij veel jongere ontwikkelingsstadia ^11,12 of vergelijking met het gebruik van in vitro basilaire papillae explantkweken ^18.