Realizzazione e di funzionamento dei dispositivi che supportano Acoustofluidic Bulk onde acustiche piedi per guaina di messa a fuoco di particelle
Summary
dispositivi Acoustofluidic utilizzano onde ultrasoniche all'interno di canali microfluidica per manipolare, concentrato e isolare micro sospeso e le entità nanoscopiche. Questo protocollo è descritta la realizzazione e il funzionamento di un tale dispositivo di supporto bulk onde stazionarie acustiche concentrarsi particelle in un snellire centrale, senza l'ausilio di fluidi guaina.
Abstract
Acoustophoresis riferisce allo spostamento di oggetti sospesi in risposta alle forze direzionali da energia sonora. Dato che gli oggetti sospesi deve essere inferiore alla lunghezza d'onda incidente del suono e la larghezza dei canali fluidici sono tipicamente decine a centinaia di micrometri di diametro, dispositivi acoustofluidic tipicamente utilizzano onde ultrasoniche generate da un trasduttore piezoelettrico impulsi ad alte frequenze (nell'intervallo megahertz ). A frequenze caratteristiche che dipendono dalla geometria del dispositivo, è possibile indurre la formazione di onde stazionarie in grado di focalizzare le particelle lungo linee di corrente fluidici desiderati all'interno di un flusso di massa. Qui, descriviamo un metodo per la fabbricazione di dispositivi acoustophoretic da materiali comuni e le attrezzature clean room. Mostriamo risultati rappresentativi per la messa a fuoco di particelle con fattori di contrasto acustiche positivi o negativi, che si muovono verso i nodi di pressione o ventri delle onde stazionarie, respectively. Questi dispositivi offrono grande utilità pratica per posizionare con precisione un gran numero di entità microscopiche (ad esempio, cellule) in ferma o fluente fluidi per applicazioni che vanno dalla citometria di assemblaggio.
Introduction
Dispositivi Acoustofluidic vengono utilizzati per esercitare forze direzionali sul entità microscopiche (ad esempio, particelle o celle) per la loro concentrazione, l'allineamento, il montaggio, parto o separazione all'interno fluidi quiescenti o flowstreams laminari. 1 In questa ampia classe di dispositivi, le forze possono essere generati da massa onde stazionarie acustiche, superficie onde stazionarie acustiche (SSAWs) 2 o in viaggio acustico onde. 3 Mentre ci concentriamo sulla fabbricazione e il funzionamento dei dispositivi di supporto di massa onde stazionarie acustiche, dispositivi che supportano SSAWs hanno ricevuto molta attenzione recentemente a causa della loro capacità di manipolare con precisione le cellule lungo le superfici 4 e rapidamente ordinare celle a canali di flusso continuo. 5 Devices supporto bulk onde stazionarie acustiche, tuttavia, ridisporre particelle sulla base delle vibrazioni meccaniche delle pareti del dispositivo generato da un trasduttore piezoelettrico, che eccita le onde stazionarie in microfluidicacavità risonanti a frequenze geometricamente definiti. Ciò consente la possibilità di generare ampiezze di pressione più elevati rispetto ai dispositivi SSAW e trasporti pertanto, più veloce acoustophoretic di entità microscopiche. 6
Queste onde stazionarie costituiti da un insieme spazialmente periodica di nodi pressione e ventri, che sono fissati in posizione, come la pressione oscilla nel tempo. Particelle rispondono alle onde stazionarie migrando ai nodi pressione o ventri, a seconda delle proprietà meccaniche delle particelle relative al fluido, e che sono descritte per il fattore di contrasto acustica:
dove le variabili ρ e β rappresentano densità e compressibilità e pedici p e ƒ rappresentano l'oggetto sospeso (ad esempio, particelle o cella) e il fluido, rispettivamente.7 entità che possiedono un fattore positivo contrasto acustico (cioè, ɸ> 0) migrano al nodo pressione (s); considerando che, le entità che possiedono un fattore di contrasto acustica negativo (vale a dire, ɸ <0) migrare verso i ventri di pressione. 7 Mentre la maggior parte dei materiali sintetici (ad esempio, polistirolo perline) e le cellule mostrano contrasto acustica positivo, particelle elastomerici a base di silicone-based materiali, 8 molecole di grasso 9 o altri costituenti altamente elastici presentano contrasto acustica negativo in acqua. Particelle elastomerici in dispositivi acoustofluidic possono essere utilizzati per isolare piccole molecole 10 e come mezzi per confinare le particelle sintetiche o 11 celle 12 ai fini di smistamento discriminate. 13
Dispositivi Acoustofluidic sono solitamente realizzati con materiali standard (ad esempio, silicio e vetro) che hanno rigidità sufficiente suPPort un onda stazionaria acustica. In molti dispositivi acoustofluidic (compreso il dispositivo illustrato), le onde meccaniche sono progettate per risuonare alla modalità armonica più bassa, che consiste di una mezza lunghezza d'onda delle onde stazionarie che attraversa la larghezza della microcanali. Questa configurazione ha un nodo di pressione al centro dei ventri dei canali e pressione lungo le periferie del canale. È stato precedentemente dimostrato che questi sistemi possono essere utilizzati per applicazioni citometria basati su chip 14-16 e applicazioni che vanno dalla cattura delle cellule alla concentrazione di cellule. 17,18
Descriviamo il processo di fabbricazione, i metodi per l'uso e la capacità di rappresentanza delle prestazioni di un dispositivo che supporta acoustofluidic rinfusa onde stazionarie acustiche. Questo dispositivo richiede un passo fotolitografia, una fase di attacco ed un passo di fusione per legare stabilmente un bicchiere "coperchio" al substrato di silicio attaccato. Notiamo che altro acoustofluididispositivi che supportano c rinfusa onde stazionarie acustiche possono essere fabbricati da capillari di vetro o quarzo legati ai trasduttori piezoelettrici, che viene descritto altrove. 19,20 dispositivi siliconici offrono i vantaggi di robustezza e di controllo sulla geometria canale di flusso, che insieme consentono numerosi tipi di elaborazione per campioni contenenti sospensioni di particelle e cellule. I dispositivi sono riutilizzabili a condizione che siano adeguatamente puliti tra usi (ad esempio, irrigando il dispositivo con tamponi e detergenti).
Protocol
Representative Results
Discussion
Acoustophoresis offre un approccio semplice e rapido per organizzare il proprio entità microscopiche all'interno di microcanali fluidici, senza la necessità di fluidi guaina utilizzati negli approcci incentrati idrodinamici. 24 Questi dispositivi offrono diversi vantaggi rispetto ad altri metodi di manipolazione di particelle o di cellule (ad esempio, magnetophoresis, 25,26 dielettroforesi 27 o inerziale forzatura 28) a causa della loro capacità di elaborare le entità senza suscettibilità magnetici elevati, polarizzabilità elettriche o un dispersity dimensione ristretta. Inoltre, i nodi di focalizzazione di un un'onda stazionaria acustica possono essere posizionati lontano dalla sorgente di eccitazione, che è qualcosa che non è possibile con campi magnetici ed elettrici statici secondo teorema di Earnshaw. 29 Un ulteriore vantaggio è che i dispositivi acustici possono concentrarsi particelle di tutti una vasta gamma di portate applicate e indipendenti dalla direzione del flusso, che non è possibile in dispositivi that contare su forze inerziali per la focalizzazione, 28 fornendo i mezzi per trasportare efficientemente particelle o cellule di ispezione particelle migliorato per applicazioni quali citofluorimetria e particelle dimensionamento. 30,31 La facilità di fabbricazione di dispositivi e il funzionamento può direttamente consentire l'attuazione simile dispositivi per la messa a fuoco, di concentrazione, di frazionamento e l'ordinamento oggetti sospesi in fluidi. 32
Abbiamo dimostrato che le forze di radiazione primari, che sono le forze forti prodotti dalle onde stazionarie acustiche, 1 possono concentrarsi microparticelle che scorre attraverso un canale microfluidico a portate superiori a 10 ml / h per un unico disegno orifizio. Per un flusso fisso di 100 microlitri / min, mostriamo che il nostro dispositivo può concentrarsi particelle in un snellire stretta (cioè, 50 micron di diametro) senza fluidi guaina a tensioni di 20 V picco-picco, consentendo un basso metodo -potenza per la discontinuo focalizzazione di 10 milioni partiCicli / min quando elabora soluzioni densamente concentrati (ad esempio, 6 x 10 8 particelle / ml), come esempio. Inoltre, questo il throughput può essere notevolmente aumentata di fabbricare multi-orifizio chip acoustofluidic o canali che vengono azionati con armoniche superiori per la produzione di serie di nodi paralleli. 33
Mentre il dispositivo qui mostrata solo richiede materiali ei metodi microfabbricazione convenzionali, si sottolinea che ci sono una manciata di altre tecniche che possono essere utilizzate per la costruzione di dispositivi simili. 19,34,35 I vantaggi di questo approccio includono la sua semplicità e la durata del dispositivo finale.
I passaggi critici per la fabbricazione di questi dispositivi includono fotolitografia per definire la geometria del microcanale, attacco con ioni reattivi per formare il canale nella bonding anodico silicio e per fondere il silicio per un "coperchio" trasparente per osservazione da fluorescence la microscopia. Tutti questi passaggi richiedono i servizi in camera pulita per evitare la raccolta di polvere e detriti all'interno del dispositivo. Una volta che questi passaggi sono complete, tuttavia, il legame di un trasduttore PZT e porti fluidici sono relativamente semplici e possono essere eseguite al di fuori di una camera pulita.
Tuttavia, il trattamento adeguato del dispositivo è essenziale per la sua longevità. Questo include (1) incubazione del dispositivo con reagenti passivanti (ad esempio, poli (etilene glicole) silano) prima di ogni esperimento per proteggere il canale da accumulo di residui e (2) lavaggio del dispositivo con detergenti dopo ogni esperimento. L'accumulo di detriti può compromettere la fedeltà dell'onda stazionaria acustica e può ridurre la capacità di concentrarsi in modo efficiente le particelle o cellule all'interno del dispositivo. Si segnala altresì che tali dispositivi non sono adatti per i campioni altamente polidispersi o campioni contenenti entità avvicina metà della dimensione dell'onda stazionaria.
Acoustofluidispositivi DIC forniscono enorme utilità per una varietà di applicazioni che vanno dalla assembly colloidale alla cella separazione e citometria a flusso. La capacità di elaborare campioni biologici con precisione ad alte portate può consentire la possibilità di un aumento dei throughput da questi dispositivi microfluidica, riducendo al contempo i costi di reagenti superflui, grandi volumi di campione o attrezzature ingombranti per l'erogazione di fluidi guaina. I metodi di fabbricazione necessari per rendere i dispositivi acoustofluidic sono semplici e le procedure necessarie per il loro funzionamento sono user-friendly. Ci auguriamo che queste procedure incoraggeranno lo sviluppo diffuso di dispositivi simili per catalizzare nuove aree di ricerca per le applicazioni in scienza dei materiali, delle biotecnologie e della medicina.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the National Science Foundation (through grants DMR-1121107, CMMI-1363483 and Graduate Research Fellowships (GRF-1106401) to C.W.S., D.F.C. and K.A.O.) and the National Institutes of Health (R21GM111584). The authors have no conflicts of interest.
Materials
| Silicon wafers | Addison Engineering, Inc. | 3P1 | 6” mechanical grade silicon wafer <111> |
| AZ® 9260 photoresist | MicroChemicals GmbH | AZ9260-Q | Positive photoresist |
| AZ® 400K developer | MicroChemicals GmbH | AZ400K CONC-CS | Dilute 1 part AZ 400k in 4 parts deionized H2O |
| H2O2 | Sigma Aldrich, Co. | 216763 | 30 wt.% in H2O |
| H2SO4 | Sigma Aldrich, Co. | 320501 | ACS reagent, 95.0-98.0% |
| 1165 Photoresist Remover | Dow Chemical, Co. | DEM-10018073 | 1-methyl-2-pyrrolidinone based |
| Acetone | Sigma Aldrich, Co. | 320110 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Isopropyl alcohol | Sigma Aldrich, Co. | W292907 | ≥99.7%, FCC, FG |
| Methanol | Sigma Aldrich, Co. | 322415 | Anhydrous, 99.8% |
| Borosilicate glass (Nexterion glass B) | Schott AG | 2098576 | Size: 120×60 ±0.1 mm, Thickness: 1 ±0.005 mm |
|
|||
| Thickness: 1 | |||
|
|||
| Drill bit for glass and ceramic | McMaster-Carr, Inc. | 2954A1 | Drill bit size: 1/8” Overall length: 2 3/16” Shank diameter: 7/64” |
| Overall length: 2 3/16” | |||
| Shank diameter: 7/64” | |||
| Polydimethylsiloxane (PDMS) kit | Sigma Aldrich, Co. | 761036 | Dow Corning, Co.; Sylgard 184®; 10 g clip-pack |
| Biopsy punch | Ted Pella, Inc. | 15078 | Harris uni-core Tip ID: 3.0 mm Tip OD: 3.40 mm |
| Tip ID: 3.0 mm | |||
| Tip OD: 3.40 mm | |||
| Lead zirconate titanate (PZT) transducer | APC International, Ltd. | Custom order, (841 WFB) | Length: 30.0 mm, Width: 5.0mm, Freq.: 2.46 MHz, 2.0 mm end wrap for leads |
| (841 WFB) | Width: 5.0mm | ||
| Freq.: 2.46 MHz | |||
| 2.0 mm end wrap for leads | |||
| Silicone tubing | Cole Parmer Instrument, Co. | 07625-22 | 0.6 mm I.D. |
| Polystyrene beads | Thermo Fischer Scientific, Inc. | F-8836 | 10 µm yellow-green fluorescence |
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