tespiti için Liyofilize Döngü aracılı İzotermal Amplifikasyon Reaktifler Gelişimi<em> Coxiella burnetii</em
Summary
We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.
Abstract
Coxiella burnetii, Q ateşi etkenidir, zorunlu hücre içi bakteridir. PCR bazlı teşhis deneyleri C saptanması için geliştirilmiştir Hücre kültürleri ve klinik örneklerde burnetii'nin DNA. PCR özel ekipman ve kapsamlı son kullanıcı eğitimi gerektirir ve bu nedenle, özellikle kaynak kısıtlı bir alanda rutin işleri için uygun değildir. Bunun C varlığını tespit etmek için bir döngü aracılı izotermal amplifikasyon (LAMP) deneyi geliştirdik hasta numunelerinde burnetti. Bu yöntem, bir su banyosu ya da ısıtma bloğu 60 ° C civarında tek bir sıcaklıkta gerçekleştirilir. Bu lamba tahlilin duyarlılığı reaksiyon başına yaklaşık 25 kopya, algılama sınırı ile PCR için çok benzer. Bu rapor, liyofilize reaktifler ve hydroxynaphthol mavisi (HNB) veya reaksiyon floresan interkalasyon boya ile UV lambası kullanılarak sonuçlar görselleştirmelerine reaksiyon hazırlanmasını tarif etmektedir. LAMP reaktifler lyophili edildized ve algılama hassasiyeti kaybı olmadan bir ay süreyle oda sıcaklığında (RT) saklandı. Reaksiyon karışımı hazırlama karmaşık adımlar içermez, çünkü bu lamba deneyi özellikle sağlamdır. Bu yöntem, Q humması endemik kaynak sınırlı ortamlarda kullanım için idealdir.
Introduction
Küçük Gram-negatif bakteri Coxiella burnetii dünya çapında bir zoonoz olan Q humması etkeni olduğunu. Nedeniyle Q Ateşi dünya çapında dağıtım ve C yüksek bulaşıcılıklarına burnetii, denizaşırı dağıtılan ABD askeri ve sivil personel endemik bölgelerde enfekte olma riski vardır.
akut ve kronik enfeksiyonların: Q humması iki şekilde tezahür eder. Akut Q-humması grip benzeri semptomlar, hepatit, pnömoni veya ile kendini göstermektedir ve genellikle düşük mortalite oranı kendini sınırlayan bir hastalıktır. Kronik Q-humması, daha az yaygın olmakla birlikte, genellikle 1,2 tedavi edilmediği takdirde çok daha yüksek bir ölüm oranına sahip endokardit ile sonuçlanır. Bu nedenle erken tanı uygun bir tedavi hasta bakımı için önemlidir rehberlik. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR) analizleri C saptanması için geliştirilmiştir hücre kültürleri ve klinik örneklerde 3-5 <de burnetii DNA/ Sup>. PCR ve qPCR Hem masraflı ve rutin işleri için kaynak kısıtlı alanlarda genellikle hazır değildir.
Başlangıçta Notomi 6 tarafından açıklanan döngü aracılı izotermal amplifikasyon (LAMP) alternatif bir DNA çoğaltma yöntemi sunuyor. LAMBA hedef genin en az altı bağımsız bölgeleri tanıyan özel olarak tasarlanmış primer kümeleri ile birlikte sarmal yer değiştirme DNA sentezi için Bst DNA polimerazı kullanır. LAMP en önemli avantajı, amplifikasyon izotermal şartlar altında gerçekleşmesidir. Bu nedenle, yalnızca su banyosu ısıtma bloğu ya da bir inkübatör gereklidir. Bu yöntem, birkaç riketsiyal patojenleri 7-9 algılamak için kullanılır olmuştur. jel elektroforezi ile yükseltilmiş DNA ürünleri Görselleştirme nedeniyle nonspesifik amplifikasyon yanlış pozitif gelen gerçek pozitifler ayırt edebilirsiniz en doğru yöntemdir. Ancak jel elektroforezinde ilgili prosedürler kaynakları sınırlı ar için pratik değildirEAS. Birkaç alternatif yöntemler tepkime ürünlerini tespit etmek için geliştirilmiştir. Magnezyum pirofosfat oluşumu 10 veya floresan interkalasyon boya kullanılarak elde edilen bulanıklık UV ışığı 11,12 altında görüntülendi edilecek gibi bu alternatif, bir jel çalışan daha elverişli. Q humması endemik 13 olduğu tropikal ve alt tropikal ülkelerde ortam sıcaklığı olan 25 ° C ve 37 ° C'de saklandığında LAMP reaktifleri bir ay boyunca stabil idi.
Bir lamba deneyi C varlığını tespit etmek için laboratuvarda geliştirilmiştir Plazma örneklerinde 14 burnetti. Burada liyofilize reaktifler lamba Reaksiyon karışımının hazırlanması için bir protokol açıklamaktadır. Oda sıcaklığında muhafaza edildiğinde liyofilize reaktif bir ay boyunca stabildir. Kolay bir görselleştirme yöntemi ile kombine edildiğinde, bu C tespit için kullanılacak ideal bir yöntemdir Bir kaynak sınırlı bir ortamda burnetti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Daha önce, ekleme elemanı IS1111a 14 hedefleyen duyarlı ve özgül LAMBA testi geliştirdi. Derece C arasında, farklı türleri arasında korunduğu için IS1111 elemanı seçilmiştir burnetti ve bakteri kopya yüksek numarası (110 7) (Klee 2006). Bizim sonuçlarımız LAMP Coxiella DNA gibi kısa bir sürede kromozomal kopyasını ilişkili olabilir IS1111 elemanı, yaklaşık 25 kopya tespit edebilen gösterdi. Bu çalışmada, Bst DNA pol…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma Deniz Araştırma Merkezi, araştırma iş birimi 6000.RAD1.J.A0310 tarafından desteklenmiştir. Bu makalede ifade edilen görüşler yazarlara aittir ve ille de Deniz Kuvvetleri, Savunma Bakanlığı, ya da ABD Hükümeti Bölümü resmi politikasını ya da yansıtmaz. Wei-Mei Ching ABD Hükümetinin bir çalışanıdır. Bu eser onun resmi görevlerinin bir parçası olarak hazırlanmıştır. Başlık 17 USC §105 'bu başlık altında Telif hakkı koruması Birleşik Devletler Hükümeti'nin herhangi bir iş için mevcut değildir.' Öngörmektedir Başlık 17 USC §101 o kişinin resmi görevlerinin bir parçası olarak askerlik üyesi veya ABD Hükümeti çalışanı tarafından hazırlanan bir eser olarak bir ABD Hükümeti işi tanımlar.
Materials
| LAMP primers | Eurofins MWG operon | 10 nmol, salt free | Sequence designed by customer |
| Bst DNA polymerase | New England Biolabs | M0275L | 8 units/ml |
| 10X Thermo pol buffer | New England Biolabs | B9004S | |
| dNTP mixture | New England Biolabs | N0447L | 10 mM each |
| Betaine | Sigma-Aldrich | B0300 | 5 M, Trimethylglycine |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M3409-1ML | 1 M |
| 10X Bluejuice | Invitrogen | 10816-015 | gel loading buffer |
| SYBR green | Invitrogen | S7585 | 10,000X, visualize products in tubes |
| GelRed | Phenix Research Products | RGB-4103 | 10,000X, visualize products in gels |
| Lyophilized reagents | Gene Reach | ||
| Hydroxynaphthol blue | Fluka | 33936-10G | |
| ESEQuant tube scanner | Qiagen | real-time detection |
References
- Anderson, A., et al. Diagnosis and management of Q fever United States, 2013: recommendations from CDC and the Q Fever Working Group. MMWR Recomm. Rep. 62 (3), 1-30 (2013).
- Rolain, J. M., Boulos, A., Mallet, M. N., Raoult, D. Correlation between ratio of serum doxycycline concentration to MIC and rapid decline of antibody levels during treatment of Q fever endocarditis. Antimicrob. Agents and Chemother. 49 (7), 2673-2676 (2005).
- Fournier, P. E., Raoult, D. Comparison of PCR and serology assays for early diagnosis of acute Q fever. J. Clin. Microbiol. 41 (11), 5094-5098 (2003).
- Schneeberger, P. M., et al. Real-time PCR with serum samples is indispensable for early diagnosis of acute Q fever. Clin. Vaccine Immunol. 17 (2), 286-290 (2010).
- Turra, M., Chang, G., Whybrow, D., Higgins, G., Qiao, M. Diagnosis of acute Q fever by PCR on sera during a recent outbreak in rural South Australia. Ann. N Y Acad. Sci. 1078, 566-569 (2006).
- Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28 (12), (2000).
- Paris, D. H., Blacksell, S. D., Newton, P. N., Day, N. P. Simple, rapid and sensitive detection of Orientia tsutsugamushi. by loo-isothermal DNA amplification. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 102 (12), 1239-1246 (2008).
- Huber, E., et al. Loop-mediated isothermal amplification assay targeting the 47-kDa gene of Orientia tsutsugamushi.: A rapid and sensitive alternative to real-time PCR. J. Med. Microb. Diagn. 1 (112), (2012).
- Pan, L., Zhang, L., Wang, G., Liu, Q. Rapid, sensitive detection of the ompB gene of spotted fever group rickettsiae by loop-mediated isothermal amplification. BMC Infect. Dis. 12 (254), (2012).
- Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 289 (1), 150-154 (2001).
- Qiao, Y. M., et al. Loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of Bacillus anthracis.spores. Biotechnol. Lett. 29 (12), 1939-1946 (2007).
- Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nat. Protoc. 3 (5), 877-882 (2008).
- Thekisoe, O. M., et al. Stability of Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) reagents and its amplification efficiency on crude trypanosome DNA templates. J. Vet. Med. Sci. 71 (4), 471-475 (2009).
- Chen, H. W., Ching, W. M. Development of loop-mediated isothermal amplification assays for rapid and easy detection of Coxiella Burnetii. J. Microbiol Methods. 107, 176-181 (2014).
- Wang, D., et al. A Comparison of In-House Real-Time LAMP Assays with a Commercial Assay for the Detection of Pathogenic Bacteria. Molecules. 20 (6), 9487-9495 (2015).
