התפתחות Lyophilized Loop בתיווך ריאגנטים הגברה איזו תרמים לצורך זיהוי של<em> Burnetii Coxiella</em
Summary
We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.
Abstract
Burnetii Coxiella, סוכן גרימת הקדחת Q, הוא חיידק תאי לחייב. מבחני אבחון מבוסס PCR פותחו לאיתור ג DNA burnetii בתרביות דגימות קליניות. PCR דורש ציוד מיוחד והכשרת משתמש קצה נרחבת, ולכן, זה לא מתאים לעבודה שיגרתית במיוחד באזור המוגבל במשאבים. פתחנו הגברת isothermal בתיווך לולאה (LAMP) assay כדי לזהות את נוכחותו של ג burnetii בדגימות המטופל. שיטה זו מבוצעת בטמפרטורה יחידה סביב 60 מעלות צלזיוס באמבט מים או בלוק חימום. הרגישות של assay LAMP זה דומה מאוד PCR עם גבול גילוי של כ -25 עותקים לכל תגובה. דו"ח זה מתאר את הכנת התגובה באמצעות ריאגנטים lyophilized ויזואליזציה של התוצאות באמצעות כחול hydroxynaphthol (HNB) או מנורת UV עם צבע intercalating פלורסנט התגובה. ריאגנטים LAMP היו lyophilized ו לאחסן בטמפרטורת החדר (RT) במשך חודש ללא הפסד של רגישות זיהוי. assay LAMP זהו חזק במיוחד משום הכנת תערובת התגובה אינה כרוך צעדים מורכבים. שיטה זו היא אידיאלית לשימוש הגדרות משאב מוגבל שבו קדחת Q הוא אנדמי.
Introduction
החיידק גראם שליליים קטנים Coxiella burnetii הוא הגורם הסיבתי של קדחת Q, שהינה זואונוסיס ברחבי העולם. בשל ההפצה העולמית של קדחת Q ואת ההדבקה גבוהה של ג burnetii, ארה"ב אנשי צבאיים ואזרחיים בפריסה רב לאומית נמצאים בסיכון להידבק בתחומי אנדמיים.
קדחת Q מבטאת בשתי צורות: זיהומים אקוטיים וכרוניים. Q-חום חריפה מציג את עצמו עם תסמינים דמויי שפעת, דלקת כבד, או דלקת ריאות, והוא בדרך כלל מחלה מעצמם עם שיעור תמותה נמוך. Q-חום כרוני, בעוד פחות נפוץ, לעתים קרובות תוצאות אנדוקרדיטיס, אשר יש שיעור תמותה גבוה בהרבה אם נותר 1,2 המטופל. לכן, אבחון מוקדם כדי להנחות את הטיפול מתאים הוא קריטי עבור טיפול בחולים. מבחני תגובת שרשרת פולימראז (PCR) בזמן אמת PCR כמותי (qPCR) פותחו לאיתור ג DNA burnetii בתרביות דגימות קליניות 3-5 </ Sup>. שני PCR ו qPCR הם יקרים ולעתים קרובות לא זמינים באזורים מוגבל משאב לעבודה שגרתית.
במקור שתאר Notomi 6, הגברת isothermal בתיווך לולאה (LAMP) מציעה שיטת הגברת DNA חלופית. LAMP משתמשת DNA פולימרז BST לסינתזת גדיל DNA עקירה יחד עם סטים פריימר ומעוצבים שמזהים לפחות לשישה אזורים עצמאיים של גן המטרה. היתרון המשמעותי ביותר של LAMP הוא הגברה מתרחשת בתנאי isothermal. לכן, רק באמבט מים, בלוק חימום או באינקובטור נדרש. שיטה זו נעשה שימוש כדי לזהות פתוגנים כמה ריקציאלי 7-9. ויזואליזציה של מוצרי ה- DNA מוגברים על ידי ג'ל אלקטרופורזה היא השיטה המדויקת ביותר שיכול להבדיל חיוביות אמיתית תוצאות חיוביות שגויות עקב הגברה ספציפית. עם זאת בהליכי ג'ל אלקטרופורזה אינם מעשיים עבור ar משאב מוגבלEAS. מספר שיטות חלופיות שפותחו כדי לגלות את תוצרי התגובה. חלופיים אלה, כגון עכירות נגזר היווצרות מגנזיום pyrophosphate 10 או באמצעות צבע intercalating פלורסנט להיות דמיינו תחת אור UV 11,12 הם נוחים יותר פועל ג'ל. ריאגנטים LAMP היו יציבים במשך חודש, כאשר הם מאוחסנים על 25 מעלות צלזיוס ו -37 מעלות צלזיוס, אשר בטמפרטורות סביבה במדינות טרופיות ותת טרופיות שבו הקדחת Q היא 13 אנדמיים.
Assay LAMP פותח במעבדה שלנו כדי לזהות את נוכחותו של ג burnetii בדגימות פלזמה 14. כאן אנו מתארים פרוטוקול פשוט להכנת תערובת התגובה LAMP מן ריאגנטים lyophilized. ריאגנטים lyophilized יציבים במשך חודש אחד, כאשר הם מאוחסנים ב RT. בשילוב עם שיטת הדמיה קלה, זוהי שיטה אידיאלית לשימוש לאיתור ג burnetii בסביבת משאב מוגבל.
Protocol
Representative Results
Discussion
בעבר, פיתחנו assay LAMP רגיש וספציפי מיקוד אלמנט הכניסה IS1111a 14. מרכיב IS1111 נבחר משום שהיא נשמרת מאוד בקרב הזנים השונים של C. burnetii ומספר גבוהים של עותקים (7 עד 110) החיידקים (קליי 2006). תוצאותינו הראו כי LAMP יכול לזהות כ -25 עותקים של אלמנט IS1111, אשר עשוי לתאם ק…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה מומן על ידי צי מחקר רפואי מרכז, יחידת עבודת מחקר 6000.RAD1.J.A0310. הדעות המובאות במאמר זה הן של הכותבים ואינם מייצגים בהכרח את המדיניות הרשמית או עמדת מחלקת הצי, משרד ההגנה, או ממשלת ארצות הברית. ויי-מיי ג'ינג הינו עובד של ממשלת ארה"ב. עבודה זו הוכנה במסגרת תפקידיהם הרשמיים שלה. כותרת 17 USC §105 קובע כי "הגנה על זכויות יוצרים תחת הכותרת הזו אינה זמינה עבור כל עבודה של ממשלת ארצות הברית." הכותרת 17 USC §101 מגדיר יצירת ממשלת ארה"ב כיצירה שהכינה חבר או עובדים שירות צבאי של ממשלת ארה"ב כחלק תפקידיו הרשמיים של אותו האדם.
Materials
| LAMP primers | Eurofins MWG operon | 10 nmol, salt free | Sequence designed by customer |
| Bst DNA polymerase | New England Biolabs | M0275L | 8 units/ml |
| 10X Thermo pol buffer | New England Biolabs | B9004S | |
| dNTP mixture | New England Biolabs | N0447L | 10 mM each |
| Betaine | Sigma-Aldrich | B0300 | 5 M, Trimethylglycine |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M3409-1ML | 1 M |
| 10X Bluejuice | Invitrogen | 10816-015 | gel loading buffer |
| SYBR green | Invitrogen | S7585 | 10,000X, visualize products in tubes |
| GelRed | Phenix Research Products | RGB-4103 | 10,000X, visualize products in gels |
| Lyophilized reagents | Gene Reach | ||
| Hydroxynaphthol blue | Fluka | 33936-10G | |
| ESEQuant tube scanner | Qiagen | real-time detection |
References
- Anderson, A., et al. Diagnosis and management of Q fever United States, 2013: recommendations from CDC and the Q Fever Working Group. MMWR Recomm. Rep. 62 (3), 1-30 (2013).
- Rolain, J. M., Boulos, A., Mallet, M. N., Raoult, D. Correlation between ratio of serum doxycycline concentration to MIC and rapid decline of antibody levels during treatment of Q fever endocarditis. Antimicrob. Agents and Chemother. 49 (7), 2673-2676 (2005).
- Fournier, P. E., Raoult, D. Comparison of PCR and serology assays for early diagnosis of acute Q fever. J. Clin. Microbiol. 41 (11), 5094-5098 (2003).
- Schneeberger, P. M., et al. Real-time PCR with serum samples is indispensable for early diagnosis of acute Q fever. Clin. Vaccine Immunol. 17 (2), 286-290 (2010).
- Turra, M., Chang, G., Whybrow, D., Higgins, G., Qiao, M. Diagnosis of acute Q fever by PCR on sera during a recent outbreak in rural South Australia. Ann. N Y Acad. Sci. 1078, 566-569 (2006).
- Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28 (12), (2000).
- Paris, D. H., Blacksell, S. D., Newton, P. N., Day, N. P. Simple, rapid and sensitive detection of Orientia tsutsugamushi. by loo-isothermal DNA amplification. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 102 (12), 1239-1246 (2008).
- Huber, E., et al. Loop-mediated isothermal amplification assay targeting the 47-kDa gene of Orientia tsutsugamushi.: A rapid and sensitive alternative to real-time PCR. J. Med. Microb. Diagn. 1 (112), (2012).
- Pan, L., Zhang, L., Wang, G., Liu, Q. Rapid, sensitive detection of the ompB gene of spotted fever group rickettsiae by loop-mediated isothermal amplification. BMC Infect. Dis. 12 (254), (2012).
- Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 289 (1), 150-154 (2001).
- Qiao, Y. M., et al. Loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of Bacillus anthracis.spores. Biotechnol. Lett. 29 (12), 1939-1946 (2007).
- Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nat. Protoc. 3 (5), 877-882 (2008).
- Thekisoe, O. M., et al. Stability of Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) reagents and its amplification efficiency on crude trypanosome DNA templates. J. Vet. Med. Sci. 71 (4), 471-475 (2009).
- Chen, H. W., Ching, W. M. Development of loop-mediated isothermal amplification assays for rapid and easy detection of Coxiella Burnetii. J. Microbiol Methods. 107, 176-181 (2014).
- Wang, D., et al. A Comparison of In-House Real-Time LAMP Assays with a Commercial Assay for the Detection of Pathogenic Bacteria. Molecules. 20 (6), 9487-9495 (2015).
