De ontwikkeling van gevriesdroogde Loop-gemedieerde Isotherme Amplification reagentia voor de detectie van<em> Coxiella burnetii</em
Summary
We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.
Abstract
Coxiella burnetii, de agent waardoor Q-koorts, is een obligaat intracellulaire bacterie. PCR gebaseerde diagnostische testen ontwikkeld voor het detecteren C. burnetii DNA in celculturen en klinische monsters. PCR vereist gespecialiseerde apparatuur en uitgebreide training van eindgebruikers, en daarom niet geschikt voor routinematige werken vooral in een gebied met beperkte hulpbronnen. We hebben a-loop gemedieerde isotherme amplificatie (LAMP) test om de aanwezigheid van C. detecteren ontwikkeld burnetii in monsters van patiënten. Deze werkwijze wordt uitgevoerd bij een temperatuur rond 60 ° C in een waterbad of verwarmingsblok. De gevoeligheid van deze assay LAMP is vergelijkbaar met PCR met een detectielimiet van ongeveer 25 kopieën per reactie. Dit rapport beschrijft de bereiding van het reactiemengsel middels gevriesdroogde reagentia en visualisatie van resultaten via Hydroxynaftolblauw blauw (HNB) of een UV-lamp met fluorescerende intercalerende kleurstof in het reactiemengsel. De LAMP reagentia waren lyophilized en bewaard bij kamertemperatuur (KT) gedurende één maand zonder verlies van detectiegevoeligheid. Dit LAMP test is bijzonder robuust omdat het reactiemengsel preparaat geen complexe stappen omvatten. Deze methode is ideaal voor gebruik in beperkte middelen waar de Q-koorts endemisch is.
Introduction
De kleine Gram-negatieve bacterie Coxiella burnetii is de verwekker van Q-koorts, die wereldwijd zoönose. Als gevolg van de wereldwijde distributie Q-koorts en de hoge infectiviteit van C. burnetii, de VS militair en civiel personeel in het buitenland ingezet lopen het risico van besmetting in de endemische gebieden.
Q-koorts manifesteert zich in twee vormen: acute en chronische infecties. Acute Q-koorts presenteert zich met griepachtige symptomen, hepatitis, of longontsteking, en is meestal een self-limiting ziekte met een lage sterfte. Chronische Q-koorts, terwijl minder gangbaar, resulteert vaak in endocarditis, die een veel hogere sterftecijfer heeft indien onbehandeld 1,2. Daarom, vroege diagnose te begeleiden een passende behandeling is van cruciaal belang voor de patiëntenzorg. Polymerase kettingreactie (PCR) en kwantitatieve real time PCR (qPCR) assays ontwikkeld voor het detecteren C. burnetii DNA in celculturen en klinische monsters 3-5 </ Sup>. Zowel PCR en qPCR zijn duur en vaak niet direct beschikbaar in resource-constrained gebieden voor routinewerk.
Oorspronkelijk beschreven door Notomi 6-loop gemedieerde isotherme amplificatie (LAMP) biedt een alternatieve DNA-amplificatie methode. LAMP gebruikt Bst DNA polymerase voor strengverplaatsing DNA-synthese met speciaal ontworpen primersets die ten minste zes onafhankelijke gebieden van het doelgen herkennen. Het belangrijkste voordeel van LAMP is dat amplificatie plaats onder isotherme omstandigheden. Daarom wordt slechts een waterbad, verwarming blok of een incubator vereist. Deze methode werd gebruikt om verschillende rickettsia ziekteverwekkers 7-9 detecteren. Visualisatie van geamplificeerde DNA-producten door gelelektroforese is de meest accurate methode die terecht positieve valse positieven kunnen differentiëren door niet-specifieke amplificatie. Maar de bij gelelektroforese procedures niet praktisch voor beperkte middelen arEAS. Verschillende alternatieve methoden ontwikkeld om de reactieproducten gedetecteerd. Deze alternatieve zoals troebelheid afgeleid van magnesiumpyrofosfaat formatie 10 of met een fluorescerende intercalerende kleurstof onder UV-licht 11,12 worden gevisualiseerd gunstiger dan het draaien van een gel. De LAMP reagentia waren een maand stabiel indien bewaard bij 25 ° C en 37 ° C, waarbij omgevingstemperatuur in tropische en subtropische landen waarin Q-koorts endemisch 13.
Een LAMP assay werd ontwikkeld in ons laboratorium om de aanwezigheid van sporen C. burnetii in 14 plasmamonsters. Hier beschrijven we een eenvoudig protocol voor de bereiding van de LAMP reactiemengsel uit de gevriesdroogde reagentia. De gevriesdroogde reagentia een maand stabiel indien bewaard bij kamertemperatuur. In combinatie met een eenvoudige visualisatiemethode is dit een ideale methode te gebruiken voor het detecteren C. burnetii in een beperkte middelen setting.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eerder hebben we een gevoelige en specifieke test gericht op de LAMP inbrengorgaan IS1111a 14. De IS1111 element werd gekozen omdat het sterk geconserveerd onder de verschillende stammen van C. burnetii en het hoge aantal kopieën (7-110) in de bacteriën (Klee 2006). Onze resultaten toonden dat LAMP ongeveer 25 kopieën van IS1111 element, die correleren met slechts een chromosomale kopie van Coxiella DNA kan detecteren. In deze studie, Bst DNA polymerase…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gesteund door het Naval Medical Research Center, onderzoek werkeenheid 6000.RAD1.J.A0310. De standpunten in dit artikel zijn die van de auteurs en geven niet noodzakelijkerwijs het officiële beleid of de positie van het Ministerie van de Marine, Ministerie van Defensie, of de Amerikaanse regering. Wei-Mei Ching is een werknemer van de Amerikaanse overheid. Dit werk werd opgesteld in het kader van haar officiële taken. Titel 17 USC §105 bepaalt dat "bescherming van het auteursrecht in het kader van deze titel is niet beschikbaar voor een werk van de Amerikaanse regering." Titel 17 USC §101 definieert een Amerikaanse regering werk als werk bereid door militaire dienst lid of werknemer van de Amerikaanse overheid in het kader van officiële taken van die persoon.
Materials
| LAMP primers | Eurofins MWG operon | 10 nmol, salt free | Sequence designed by customer |
| Bst DNA polymerase | New England Biolabs | M0275L | 8 units/ml |
| 10X Thermo pol buffer | New England Biolabs | B9004S | |
| dNTP mixture | New England Biolabs | N0447L | 10 mM each |
| Betaine | Sigma-Aldrich | B0300 | 5 M, Trimethylglycine |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M3409-1ML | 1 M |
| 10X Bluejuice | Invitrogen | 10816-015 | gel loading buffer |
| SYBR green | Invitrogen | S7585 | 10,000X, visualize products in tubes |
| GelRed | Phenix Research Products | RGB-4103 | 10,000X, visualize products in gels |
| Lyophilized reagents | Gene Reach | ||
| Hydroxynaphthol blue | Fluka | 33936-10G | |
| ESEQuant tube scanner | Qiagen | real-time detection |
References
- Anderson, A., et al. Diagnosis and management of Q fever United States, 2013: recommendations from CDC and the Q Fever Working Group. MMWR Recomm. Rep. 62 (3), 1-30 (2013).
- Rolain, J. M., Boulos, A., Mallet, M. N., Raoult, D. Correlation between ratio of serum doxycycline concentration to MIC and rapid decline of antibody levels during treatment of Q fever endocarditis. Antimicrob. Agents and Chemother. 49 (7), 2673-2676 (2005).
- Fournier, P. E., Raoult, D. Comparison of PCR and serology assays for early diagnosis of acute Q fever. J. Clin. Microbiol. 41 (11), 5094-5098 (2003).
- Schneeberger, P. M., et al. Real-time PCR with serum samples is indispensable for early diagnosis of acute Q fever. Clin. Vaccine Immunol. 17 (2), 286-290 (2010).
- Turra, M., Chang, G., Whybrow, D., Higgins, G., Qiao, M. Diagnosis of acute Q fever by PCR on sera during a recent outbreak in rural South Australia. Ann. N Y Acad. Sci. 1078, 566-569 (2006).
- Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28 (12), (2000).
- Paris, D. H., Blacksell, S. D., Newton, P. N., Day, N. P. Simple, rapid and sensitive detection of Orientia tsutsugamushi. by loo-isothermal DNA amplification. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 102 (12), 1239-1246 (2008).
- Huber, E., et al. Loop-mediated isothermal amplification assay targeting the 47-kDa gene of Orientia tsutsugamushi.: A rapid and sensitive alternative to real-time PCR. J. Med. Microb. Diagn. 1 (112), (2012).
- Pan, L., Zhang, L., Wang, G., Liu, Q. Rapid, sensitive detection of the ompB gene of spotted fever group rickettsiae by loop-mediated isothermal amplification. BMC Infect. Dis. 12 (254), (2012).
- Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 289 (1), 150-154 (2001).
- Qiao, Y. M., et al. Loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of Bacillus anthracis.spores. Biotechnol. Lett. 29 (12), 1939-1946 (2007).
- Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nat. Protoc. 3 (5), 877-882 (2008).
- Thekisoe, O. M., et al. Stability of Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) reagents and its amplification efficiency on crude trypanosome DNA templates. J. Vet. Med. Sci. 71 (4), 471-475 (2009).
- Chen, H. W., Ching, W. M. Development of loop-mediated isothermal amplification assays for rapid and easy detection of Coxiella Burnetii. J. Microbiol Methods. 107, 176-181 (2014).
- Wang, D., et al. A Comparison of In-House Real-Time LAMP Assays with a Commercial Assay for the Detection of Pathogenic Bacteria. Molecules. 20 (6), 9487-9495 (2015).
