低质量和低数量肿瘤活检丰枯台过程的集成优化了有针对性的下一代测序

注意：此协议描述了使用MiSeq NGS系统的样品的同时处理，而是可以适用于个人基因组机（PGM）的仪器。对于400扩增模板份建议的最低DNA输入，分析能够产生至少平均3,000倍覆盖每一个每NGS运行96个样品，和等效覆盖深度使用PGM一个318芯片上的24个样品。该方法还需要使用实时PCR仪器。 1. DNA定量的功能和质量控制（QC） 解冻试剂：2倍主混合物，引物探针混合物，抑制引物探针混合物，6-羧基-X-罗丹明（ROX），稀释剂，和四个人类基因组DNA的校准曲线的标准（DNA标准（50纳克/微升），DNA的标准（10纳克/微升），DNA标准（2纳克/微升），和DNA标准（0.4毫微克/微升））（ 表1）。旋涡以最大速度为10秒所有试剂，持续10秒，离心收集内容。保持冰的2倍母液。 制备主混合物的足够量的样品的总数进行测试和包括10％体积，以避免由于移液短缺。使用每样以下几卷，准备在离心管的主结构：5微升2X预混液，0.5微升引物探针混合，0.5微升抑制引物探针混合，0.05微升ROX和2.95微升稀释剂。涡旋10秒和离心机以最大速度为10秒，收集内容。 添加9微升主混合物到96孔板的孔中。 加入1微升的DNA标准的一式两份，以产生校准曲线。移液器向上和向下的5倍混合。 确保核酸样品在使用前充分混合。 1微升样品添加到主结构和吹打混淆和向下的5倍。 密封10秒，离心平板，涡旋在最大速度为10秒，收集内容。 放置板进入PCR系统。分配两个FAM（功能量化）和VIC（功能抑制）根据制造商的说明对每个样品检测器。在95℃（在95℃下，在60℃下1分15秒）进行10分钟的PCR循环，和40个循环。 通过产生一个线性回归曲线图对于每个使用软件协议的重复DNA的标准分析定量PCR数据。 积的拷贝数的对数10为在x轴各DNA标准和在y轴上的相应FAMÇQ值。 确认从核酸样品落在该DNA标准校正曲线的动态范围内的结果，然后从参考标准曲线上的对应位置计算未知DNA的浓度在“功能性”或可扩增拷贝数每微升。 图1显示了通过和失败校准曲线的例子。</ LI> 确定是否在每个反应发生通过检查非人类靶扩增子中的VIC通道中存在的扩增。 注意：作为阳性对照，在抑制引物探针混合物包含特异于非人类外源目标和相应的模板的引物。的抑制引物探针混合物是被加入到每个反应，包括无模板对照（NTC）的主混合物的成分。在缺乏抑制剂，对非人类的目标PCR产物应始终在VIC通道检测。在VIC通道一个样本的“未检测到”C Q表示可从样品之前进一步处理之后清理受益PCR抑制剂的存在。 2.文库制备：基因特异性（GS）PCR 制备主混合物的足够量为待测试的样品的总数，并包括10％的体积，以避免由于pipett短缺ING。使用每样本下面的卷准备在微量离心管在GS PCR主混合物：5微升2×扩增主混合物（ 表1）和1μl泛癌症底漆面板（ 表1）。移液器向上和向下，涡旋10秒和离心机以最大速度为10秒，收集内容混合。 分装6微升的GS PCR主混合物到96孔板的孔中。加入4微升各核酸样品放入单独的井。到其它孔， ​​加入4微升FFPE控制的（ 表1），4微升多变量控制（ 表1）的，和4微升不含核酸酶的水用于一个程序的NTC。对于每个另外，通过吹打向上和向下5次混合。 密封10秒，离心平板，涡旋在最大速度为10秒，收集内容。 放置在热循环仪的板用于以下PCR循环：5分钟95℃，2个周期（15秒95℃，在60℃下4分钟），23个循环（在95℃下，在72℃4分15秒），和10分钟，在72℃最终延伸。保持在4℃。 注意：步骤2.4的结束后，将板将作为对GS PCR板被引用。 3.文库制备：PCR标记解冻试剂：2X指数预混液（ 表1），指数代码（ 表1）。涡旋10秒和离心机以最大速度为10秒，收集内容。 注意：索引代码预混，以提供一组唯一的成对指数（条码）每个样品的。 在96孔板，加入2倍指数预混的7.5微升和指数代码的5.5微升到指定的井和吹打混淆和向下的5倍。 小心打开GS PCR板，加入2μLGS PCR产物与预混新盘。移液器向上和向下的5倍混合。对于每个样品，记录样品标识和相应的配对指数代码。密封10秒，离心平板，涡旋在最大速度为10秒，收集内容。 放置在热循环仪和PCR 5分钟的板在95℃下，10个循环（30秒95℃，55℃，72℃1分30秒），和10分钟，在72最后延伸C。保持在4℃。 注意：步骤3.4的结束后，将板将作为标记PCR板被引用。 4.图书馆纯化和大小选择从2-8℃，取出库纯准备磁珠（ 表1）和洗脱缓冲液（ 表1），并允许平衡至室温30分钟。 9.6毫升100％乙醇添加至洗涤缓冲液（ 见表1）的容器中，盖和颠倒瓶子几次混匀。 涡旋10秒磁珠，并添加11微升到9的分开的孔6孔板中。 打开标签PCR板加入10微升标记PCR产物的珠和吸管搭配5倍。孵育混合物在RT 4分钟。 放置在磁性支架（ 见表1）的96孔板于4分钟。随着仍是96孔板上的立场，删除和丢弃用吸管取上清液。 从磁性支架取出96孔板，并添加100μl的含有乙醇的洗涤缓冲液到每个孔中，并通过移液混合向上和向下的5倍。孵育2分钟。 放置在磁性支架2分钟的96孔板，然后取出并丢弃用吸管将上清液。 重复步骤4.5，为总共2乙醇洗涤后，第二次洗涤后，除去尽可能多的洗涤液成为可能。 与在磁性支架上的96孔平板，干燥珠粒在室温下2分钟，然后从支架移除板。 通过加入20微升洗脱缓冲液，以每逢重悬珠子升和吸管向上和向下的5倍。 在室温下孵育2分钟。 放置96孔板背面上的磁性支架4分钟，并小心地取出并转移18微升上层清液，以一个新井。 注意：程序可以安全地停止在这一步和样品储存在-15至-30℃。要重新启动，继续操作前在冰上解冻冷冻样品。 5.图书馆量化解冻库定量（LQ）试剂：2倍LQ主混合物，LQ引物/探针混合，LQ标准，LQ阳性对照，LQ稀释剂，和LQ ROX（ 表1）。涡旋10秒和离心机以最大速度为10秒，收集内容。 使用纯化的文库的产品，执行LQ稀释剂每个单独样品的系列稀释。 加入2微升（库纯化产品），以198微升LQ稀释剂及混合向上和向下用吸管10倍。 加入2微升（1：100稀释）至198微升LQ稀释剂及混合使用吸管10次向上和向下。 制备LQ主混合物的足够量的样品的总数进行测试和包括10％体积，以避免由于移液短缺。使用每样本下面的卷准备LQ主混合物在微量离心管中：5微升2X LQ预混，2微升LQ引物/探针混合，0.5微升LQ标准和0.5微升LQ ROX。移液器向上和向下，涡旋10秒和离心机以最大速度为10秒，收集内容混合。 添加8微升LQ主结构的光学96孔板的孔中。 在单独的孔中，加入2微升稀释文库，2微升LQ阳性对照和2μlLQ稀释剂（NTC）和移液器向上和向下5次混合。密封用光学粘合剂膜，涡流板10秒和离心机在400×g离心10秒收集内容。 同时将与FAM和VIC DETECTORS每个样品。在95℃（在95℃下，在60℃下1分15秒）执行使用5分钟的循环条件进行PCR扩增，和40个循环。 确定使用比例C Q滤波方法各样品（纳米）的浓度。计算已知LQ标准（C q VIC）未知库（C q FAM）的区别。稀释样品（PM）的浓度，使用下式计算： [ 浓度LIB] 纳米 = 12.5×2ΔCq的 如果使用超过10,000之外的稀释因子，计算目标稀释因子的比率至10,000，并通过在5.7的等式的结果乘以该因子。 6.图书馆规范化和样本池确定平均浓度（NM）在所有样本（每片含独特的配对指数），以统筹。 确定个体样品volumE（微升）由5在所有样本中位数乘以浓度，然后由它的个体浓度（NM）除以汇集。轮所得到的值到最接近的整数。圆卷带值<2微升至2微升，和卷> 15微升至15微升。 每个样品的归一化体积（微升）添加到单个的离心管以形成样品池。 计算使用圆整数值每个样品的新浓度并记录结果。 确定样品池的浓度，计算所有个体浓度的总和，并记录所得到的值（nm）的。 稀释样品池使用排序稀释液（ 表1）1.25纳米。 注意：程序可以安全地停止在这一步和样品储存在-15至-30℃。要重新启动，继续操作前在冰上解冻冷冻样品。 7.测序代纳URE加入以下的PhiX控制V3（ 表1）存在的样品池：15微升1.25 nm样品池，3微升0.5纳米PhiX和2微升的1N NaOH的。短暂涡旋后短暂的离心和在室温下孵育5分钟。 广场上冰的变性样品池。 添加8微升变性库到992微升预冷HT1-HYB缓冲到一个离心管中。短暂涡旋混合，随后简要介绍离心收集内容。置于冰上。 加入600微升变性及摊薄库来定位试剂盒＃17。 解冻读取1测序引物（ 表1），索引读测序引物（ 表1），并阅读2测序引物（ 表1）。在离心管，分别与稀释636微升HT1-HYB缓冲4微升测序引物。注：HT1-HYB缓冲区是提供智慧小时测序试剂盒（ 表1）。 通过以最大速度涡旋10秒并离心10秒，收集内容混合。加入600微升稀释读1测序引物的定位测序试剂盒＃18，600微升稀释指数读取引物定位＃19，和600微升稀释读2测序引物的定位＃20。 根据制造商的说明上加载的NGS仪器（ 表1）和序列的试剂。执行配对末端2×150循环测序运行。 8.数据分析注：NGS仪器软件集群图像转换到基本通话和质量评分，解复用两两指标产生个别gzip压缩FASTQ（* .fastq.gz）文件对每个样品。之前分析所述解复用后的文件，读者必须下载并安装相关的生物信息学软件（ 表1）。该软件可以在消费级的Windows PC上安装，并不需要专门的计算机硬件或网络连接进行数据分析。 双击软件桌面图标。 登录使用在软件手册中提供的用户名和密码登入系统。 打开该项目的仪表板，然后单击“新建项目”。 命名该项目，并提供一个可选的项目描述。选择有针对性的NGS面板类型和NGS仪器类型。点击“保存并继续”。 上传前压缩文件FASTQ和反向读取。不要上传“未分配”FASTQs，其中包含读取未能解复用。点击“保存并继续”。 输入的作为由该DNA官能定量测定（见上述步骤1）测定的以制备每个库功能的输入拷贝数。手动从价差中添加值或复制和粘贴值片成注释表。点击“保存并继续”。 查看上传用于分析的注释库，并点击“提交分析”启动的分析。 监测通过项目仪表盘显示的分析的进度。 注：当结果准备好审查提出了一个完整的分析状态指示。 复查样品质控指标分析结果，包括每个库全覆盖，百分比读取路过滤器，扩增覆盖的深度和均匀性。查看变种呼吁与dbSNP数据库，COSMIC，1000基因组和功能和人口级别的注释其他来源的每个测序库。 导出的原始结果总结电子数据表的表，* .bam文件和* .vc​​f文件用于长期贮存或下游分析互补信息学工具。