التكامل بين الرطب والعمليات مقعد الجافة يحسن المستهدفة تسلسل الجيل التالي من ذات جودة منخفضة ومنخفضة كمية التحليلات ورم
Summary
An integrated system for targeted next-generation sequencing of oncology specimens is described. This cross-platform system is optimized for low-quality and low-quantity tumor biopsies, accommodates low DNA inputs, includes well-characterized multi-variant controls, and features a novel variant caller that is informed by quantitative pre-analytical quality control measures.
Abstract
تشمل جميع الإجراءات الجيل المقبل من التسلسل (خ ع) فحوصات أجريت في مقاعد البدلاء المختبر ( "مقعد الرطب")، وبيانات التحليلات التي أجريت باستخدام المعلوماتية الحيوية خطوط الأنابيب ( "مقعد الجافة"). كلا العناصر ضرورية لتحقيق نتائج دقيقة وموثوق بها، والتي تعتبر بالغة الأهمية خاصة بالنسبة للمختبرات السريرية. وقد وجدت تقنيات خ ع تزايد استهداف صالح في تطبيقات علم الأورام للمساعدة في الأهداف الطب الدقة مسبقة، إلا أن الأساليب غالبا ما تنطوي على قطع ومتغير الرطب والجاف سير العمل مقاعد البدلاء، ومجموعات الكاشف غير منسقة. في هذا التقرير، وصفنا أسلوبا لتسلسل تحديا عينات السرطان مع لوحة 21-جين كمثال على نظام خ ع المستهدفة شامل. نظام يدمج وظيفية الكمي الحمض النووي والتأهيل، واحد أنبوب المضاعفة تخصيب PCR، وتنقية مكتبة والتطبيع باستخدام التحقق التحليلية، الكواشف واحد المصدر مع مجموعة المعلوماتية الحيوية مستقل.ونتيجة لذلك، يدعو دقيق البديل من منخفضة الجودة وكمية منخفضة الثابتة الفورمالين، (FFPE)، ويمكن أن يتحقق غرامة بالإبرة (FNA) خزعات الورم جزءا لا يتجزأ من البارافين. هذه الطريقة يمكن تقييم روتيني المتغيرات المرتبطة بالسرطان من المدخلات من 400 نسخة الحمض النووي amplifiable، وليس وحدات في تصميم لاستيعاب محتوى الجين الجديد. نوعين مختلفين من الضوابط المحددة من الناحية التحليلية، وتوفر ضمان الجودة وتساعد على الحفاظ على دقة الدعوة مع عينات سريريا ذات الصلة. أ "سمة" خطوة PCR مرنة ضمنت الفيديو محولات الخاصة بالنظام الأساسي ورموز مؤشر للسماح عينة المتوازية والتوافق مع الفوق المشترك أدوات خ ع. الأهم من ذلك أن البروتوكول هو تبسيط ويمكن أن تنتج 24 مكتبات تسلسل جاهزة في غضون يوم واحد. وأخيرا، فإن نهج يربط العمليات مقاعد البدلاء الرطب والجاف من خلال دمج نتائج الرقابة قبل التحليلية جودة العينة مباشرة إلى البديل الدعوة خوارزميات لتحسين طفرة دقة الكشف والتفريق سلبية كاذبة وindetermالمكالمات إلصدار. يستخدم هذا الأسلوب خ ع المستهدفة التقدم في كل من الجهاز العصبي والبرامج لتحقيق ارتفاع العمق، والتسلسل المضاعفة وتحليل حساسية عينات سرطان غير متجانسة لتطبيقات التشخيص.
Introduction
يعتمد الطب الدقة على الفردية من الخيارات التشخيصية والعلاجية للمرضى. وعد علاجات مصممة هو نتيجة مباشرة لتحسين فهم مسارات الأمراض التي يمكن أن تثري ربط التشخيص الجزيئي والعلاجات المستهدفة. على سبيل المثال، زاد استخدام العلاجات المستهدفة جزيئيا-من 11٪ إلى 46٪ 2003-2013 1، والأدوية المضادة للسرطان مثل vemurafenib وcrizotinib وادارة الاغذية والعقاقير تطهيرها مع الاختبارات التشخيصية رفيق. مع قدرته على استعادة بدقة، وفرة منخفضة أهداف تسلسل عبر مجموعات عينة المضاعفة للغاية، وقد برز جيل المقبل من التسلسل (خ ع) كوسيلة من وسائل الاختيار لتقييم الانحرافات الجينية المرتبطة بسرطان وتحديد الأهداف الجزيئية للطب الدقة.
وتشمل الخزعات السرطانية الصلبة الأكثر شيوعا لاختبار الجزيئي الثابتة الفورمالين، جزءا لا يتجزأ من البارافين (FFPE) وطموح غرامة إبرة (FNA) specimENS. هذه العينات محفوفة مع كمية منخفضة و / أو ذات جودة منخفضة الأحماض النووية التي تتحدى دقيقة خ ع التقييمات 2-5. وتعتمد أساليب NGS التجارية الحالية لتحليل هذه العينات على خليط من المواد الكيميائية المختلفة، والبروتوكولات، والمعلوماتية الأدوات التي تمثل أهدافا مؤثرة من التحسينات المستمرة. على سبيل المثال، حدثت تغييرات في كيمياء فحص و / أو البرامج كل 1-2 أشهر للالأكثر شيوعا-خ ع مجموعات المستهدفة 6. ويعكس هذا عدم الاستقرار وانعدام التناسق في بناء والتحقق من نظام خ ع موحد لأنواع العينات الصعبة، وخصوصا للاختبار السرطان، ويضع عبئا لا مبرر له على مختبرات لتطوير بروتوكولات متماسكة التي هي الأمثل من عينة إلى النتائج. في الواقع، أبرز الاستطلاع الأخير الذي حدث من المستخدمين خ ع و الصعوبات التي تواجه هذه التقنيات "التغير السريع"، جنبا إلى جنب مع متطلبات المنشأة، والمحتوى طبيا للتنفيذ والخبرة المعلوماتية الحيوية الراسخة، وsolidifiإد والإجراءات المتكاملة التي يمكن تنفيذها بسرعة، وتبسيط سير العمل والبروتوكولات مبسطة تسهل تدريب في موقع العمل (7). في هذه المقالة، يوصف نظام شامل لخ ع المستهدفة التي يعالج هذه الثغرات.
منهجية عرض يدمج جميع الخطوات الإجرائية من قبل التحليلية لمرحلة ما بعد التحليلية في مقاعد كلا الرطب والجاف لتحسين دقة وحساسية، وموثوقية القياس الكمي الهدف والكشف عن NGS من مواضع جين سرطان سريريا ذات الصلة. يبدأ هذا النهج مع الكمي من الحمض النووي "الوظيفي" 4 لتقييم نوعية الحمض النووي، وتوجيه المدخلات في خطوة تخصيب PCR، والحذر من دعوات إيجابية كاذبة التي يمكن أن تنشأ من استجواب النسخ قالب منخفضة جدا. ومتعدد واحد أنبوب PCR ثم يغني لمدة 46 مواضع في 21 جينات السرطان باستخدام فقط 400 نسخة الحمض النووي amplifiable، تليها إدراج تسلسل الخاصة بالنظام الأساسي للخ ع النقيبز أدوات التسلسل سطح المكتب المشترك. ويتم تنقية المكتبات باستخدام إجراء حبة المغناطيسي بسيطة وكميا مع رواية، خالية من معايرة QPCR الفحص. وثمة مجموعة المعلوماتية الحيوية مستقل، أبلغ من قبل عينة نتائج فحص الحمض النووي لمراقبة الجودة لتحسين أداء المكالمة، ويوفر تحليل التسلسل التالي خ ع. نقدم البيانات باستخدام هذا منهج النظم لخ ع المستهدفة للكشف عن الطفرات قاعدة الاستبدال، الإدراج / الحذف (indels)، ونسخ عدد المتغيرات (التنوعات في عدد النسخ) في ذات جودة منخفضة وورم كمية منخفضة الخزعات مثل FFPE وعينات FNA، وتشغيل ضوابط.
Protocol
Representative Results
Discussion
وإعادة تعريف التكنولوجيا خ ع التوقعات لاستجواب لمحات الجزيئية للخزعات الورم في السريرية 9. وقد تم تطوير عدد من لوحات خ ع المستهدفة وتقنيات البحث والاختبارات المعملية المتقدمة، والمنتجات المتاحة تجاريا وألواح مخصصة لتقييم أنواع متعددة من العينات السريرية 3،5،10-15. وقد أظهرت التقارير الواردة من عدة دراسات قيمة خ ع كأداة السريرية الحساسة ومحددة للكشف عن تغيرات الجيني 3،10-12،14. ومع ذلك، فقد أثبتت الدراسات أيضا خطر من القطع الأثرية التي يمكن أن تسبب نتائج إيجابية كاذبة من الخزعات سرطان الصعبة مثل FFPE العينات 2-5،12،14. بالإضافة إلى ذلك، أبرزت المنشورات الحديثة معدلات فشل عالية لخ ع باستخدام الأورام العينات 16 و إيجابية كاذبة مكالمات مع فريقي خ ع المستهدفة التجارية التي تفاقمت من جراء استخدام الحمض النووي المنخفضة للمدخلات 12. ونتيجة لذلك، بعض مختبروقد المحافظين إما تعديل أو تضاف الضوابط والتوازنات إضافية إلى المتاحة تجاريا التقنيات خ ع المستهدفة لتحسين الأداء، في كثير من الأحيان لضمان دقة أو تأكيد النتائج من بيوينفورمتيك يحلل 5،10،11.
وقد تم تطوير لوحة 21-جين (الشكل 2)، والمحتوى المستهدفة لنظام شامل خ ع لاستجواب قائم على الأدلة، والطفرات قابلة للتنفيذ في أنواع العينات الصعبة مثل FFPE وFNA خزعات الورم. سير العمل لديها عدد من المزايا: 1) الاتساق من خلال توفير تغطية amplicon موحدة (أرقام 3 و 4، الجدول 3). 2) سهولة الاستخدام من خلال توفير ما قبل صياغتها، ومجموعات كاشف الأمثل، وتبسيط متطلبات المعلوماتية الحيوية. 3) الكفاءة من خلال تبسيط سير العمل والحد من عدد من الخطوات pipetting لبالمقارنة مع الأساليب خ ع و التجارية الأخرى. و4) دقة من خلال دمج فحص الحمض النووي لمراقبة الجودة لتقييم amplifiتمكن عدد نسخ الحمض النووي لضمان تنوع قالب مقبول وتجنب التقلبات العشوائية في كشف البديل 4. تكامل البيانات QC قبل التحليلي مع تحليل المعلوماتية الحيوية يسمح للمدخلات منخفضة من FFPE الحمض النووي. وقد تحقق ذلك من خلال تدريب خوارزمية القرار الشجرة باستخدام نسخ وظيفية مختلفة من المدخلات الحمض النووي عبر 400 عينات FFPE مع تدابير مستقلة للحقيقة، وتتضمن هذه الخوارزمية في البرنامج بيوينفورمتيك. ونتيجة لذلك، فإن إدخال الموصى بها من 400 نسخة amplifiable، أي ما يعادل عادة إلى ~ 5-20 نانوغرام من FFPE الحمض النووي، ويقارن ايجابيا إلى أساليب أخرى 10-12، بما في ذلك تخصيب القائم على التهجين حيث ينصح ~ 250 نانوغرام من الحمض النووي FFPE 17،18 . وعلى الرغم من وصف هذه التقنية للاستخدام على منصة MiSeq، فإنه يمكن تعديلها باستخدام بطاقة PCR الاشعال مع محولات أداة محددة لتمكين تحليل تسلسل على منصات خ ع و غيرها.
عدة خطوات حاسمة لضمان نجاحمن هذا الإجراء. يحدد QC فحص ما قبل التحليلي عدد نسخ amplifiable من الحمض النووي وتقارير تثبيط وظيفي. ومع ذلك، إذا تم استخدام أقل من 400 نسخة الحمض النووي amplifiable في خطوة تخصيب PCR، هناك خطر متزايد من مكالمة سلبية كاذبة من العينات مع الطفرات وفرة منخفضة (الشكل 6). بالإضافة إلى ذلك، يجب توخي الحذر خلال تنقية المكتبة لمنع الإفراط في تجفيف حبات مغناطيسية أثناء الغسل أو شطف الخطوات. وعلاوة على ذلك، النجاح الكمي مكتبة يعتمد بشكل كبير على تخفيف دقيقة من الحمض النووي مكتبة. للحصول على أفضل النتائج، والفرق من QPCR النتائج للمكتبة عينة (الكلوروكوين FAM) مقارنة LQ قياسي (الكلوروكوين VIC) يجب أن يكون ≤3.3 الكلوروكوين. إذا كان الفرق أكبر من 3.3 الكلوروكوين، وإعادة تخفيف واختبار عينة من المستحسن. على الرغم من أن علاقة ممتازة وقد لوحظ بين هذه الطريقة QPCR تنافسية ومجموعات تجارية التي تقدم الكمي المطلق باستخدام منحنى قياسي، إزاحة المدخلات مكتبة في خطوة التضخيم نسيلي نسبة إلى أساليب أخرى قد يكون من الضروري لتحقيق كثافة البذر المثلى.
بعض العينات السرطان بشكل خاص تحديا لتسلسل بسبب مثبطات أن تستمر بعد عزل الحمض النووي. للتعرف على هذه العينات قبل إعداد المكتبة، وفحص QPCR QC أيضا بالكشف عن التضخيم تثبيط من قبل بما في ذلك قالب خارجي يخدم على حد سواء الرقابة الداخلية والحارس لتثبيط وظيفي. ويقدم مثالا في الشكل (3) التي فشلت عينة سرطان الجلد الحمض النووي لتمرير تثبيط QC متري قبل التسلسل ثم فشلت في إنشاء مكتبة يمكن أن تكون متسلسلة. كان الفشل المحتمل نتيجة لتلوث الميلانين، مثبط PCR المعروفة، التي تم ترحيلها من الخطوة العزلة FFPE الحمض النووي. العينات التي يتم تحديدها من قبل فحص ومراقبة الجودة لتكون معرضة للخطر لعدم التضخيم يمكن إنقاذه من خلال ر خطوة تنظيف إضافيةس إزالة مثبطات المحتملة.
تركز لوحة 21 الجينات المستهدفة في المناطق الساخنة الجينات القائم على الأدلة وتوفر نظاما كاملا مع الكواشف والضوابط الأمثل لالحمض النووي QC، خ ع والمعلوماتية الحيوية البرامج التي يتم أبلغ من نتائج فحص الحمض النووي الكمي "وظيفية" قبل التحليلية. طريقة يكشف بدقة الطفرات قاعدة الاستبدال وindels من الحمض النووي المدخلات المنخفضة، وتقدم مثالا على نظام NGS مع خيار لتوسيع المحتوى لوحة، لكشف عن بدائل إضافية مثل هذه التنوعات وتكييفها لتسلسل الحمض النووي الريبي المستهدفة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتور أنيت Schlageter لإعادة النظر في المخطوطة. وأيد هذا العمل في جزء من CP120017 منحة من الوقاية من السرطان ومعهد بحوث من تكساس (PI: GJL).
Materials
| 2x Quantidex Master Mix | Asuragen | 145345 | |
| Quant Primer Probe Mix | Asuragen | 145336 | |
| Inhibition Primer Probe Mix | Asuragen | 145344 | |
| ROX | Asuragen | 145346 | |
| Diluent | Asuragen | 145339 | |
| DNA Standard (50) | Asuragen | 145340 | |
| DNA Standard (10) | Asuragen | 145341 | |
| DNA Standard (2) | Asuragen | 145342 | |
| DNA Standard (0.4) | Asuragen | 145343 | |
| 2X Amplification Master Mix | Asuragen | 145348 | |
| Pan Cancer Primer Panel | Asuragen | 145347 | |
| Pan Cancer FFPE Control | Asuragen | 145349 | |
| Pan Cancer Multi-Variant Control | Asuragen | 145350 | |
| Library Pure Prep Beads | Asuragen | 145351 | |
| Wash Buffer | Asuragen | 145352 | |
| Elution Buffer | Asuragen | 145353 | |
| 2X LQ Master Mix | Asuragen | 145358 | |
| LQ Diluent | Asuragen | 145354 | |
| LQ Positive Control | Asuragen | 145355 | |
| LQ Standard | Asuragen | 145356 | |
| LQ Primer / Probe Mix (ILMN) | Asuragen | 145357 | |
| LQ ROX | Asuragen | 145359 | |
| Index Codes (ILMN) – Set A, AIL001 – AIL048 (48) | Asuragen | 150004 | |
| AIL001 – AIL048 (48) | |||
| Index Codes (ILMN) – Set B, AIL049 – AIL096(48) | Asuragen | 150005 | |
| AIL049 – AIL096(48) | |||
| 2X Index Master Mix | Asuragen | 145361 | |
| Read 1 Sequencing Primers | Asuragen | 150001 | |
| Index Read Sequencing Primers | Asuragen | 150002 | |
| Read 2 Sequencing Primers | Asuragen | 150003 | |
| Sequencing Diluent | Asuragen | 145365 | |
| Illumina MiSeq | Illumina | ||
| MiSeq Reagent Kit v3 (600-cycle) | Illumina | MS-102-3003 | |
| MiSeq Reagent Nano Kit v2 (300-cycle) | Illumina | MS-103-1001 | |
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | |
| Magnetic Stand-96 (Or equivalent device) | Ambion | AM10027 | |
| Quantidex Reporter Software | Asuragen |
References
- Chen, G., Mosier, S., Gocke, C. D., Lin, M. T., Eshleman, J. R. Cytosine deamination is a major cause of baseline noise in next-generation sequencing. Mol Diagn Ther. 18 (5), 587-593 (2014).
- Choudhary, A., et al. Evaluation of an integrated clinical workflow for targeted next-generation sequencing of low-quality tumor DNA using a 51-gene enrichment panel. BMC Med Genomics. 7, 62 (2014).
- Sah, S., et al. Functional DNA quantification guides accurate next-generation sequencing mutation detection in formalin-fixed, paraffin-embedded tumor biopsies. Genome Med. 5 (8), 77 (2013).
- Zhang, L., et al. Profiling cancer gene mutations in clinical formalin-fixed, paraffin-embedded colorectal tumor specimens using targeted next-generation sequencing. Oncologist. 19 (4), 336-343 (2014).
- Latham, G. J. Next-generation sequencing of formalin-fixed, paraffin-embedded tumor biopsies: navigating the perils of old and new technology to advance cancer diagnosis. Expert Rev Mol Diagn. 13 (8), 769-772 (2013).
- Crawford, J. M., et al. The business of genomic testing: a survey of early adopters. Genet Med. 16 (12), 954-961 (2014).
- Smith, D. L., et al. A multiplex technology platform for the rapid analysis of clinically actionable genetic alterations and validation for BRAF p.V600E detection in 1549 cytologic and histologic specimens. Arch Pathol Lab Med. 138 (3), 371-378 (2014).
- Thomas, F., Desmedt, C., Aftimos, P., Awada, A. Impact of tumor sequencing on the use of anticancer drugs. Curr Opin Oncol. 26 (3), 347-356 (2014).
- Singh, R. R., et al. Clinical validation of a next-generation sequencing screen for mutational hotspots in 46 cancer-related genes. J Mol Diagn. 15 (5), 607-622 (2013).
- Beadling, C., et al. Combining highly multiplexed PCR with semiconductor-based sequencing for rapid cancer genotyping. J Mol Diagn. 15 (2), 171-176 (2013).
- McCall, C. M., et al. False positives in multiplex PCR-based next-generation sequencing have unique signatures. J Mol Diagn. 16 (5), 541-549 (2014).
- Schleifman, E. B., et al. Next generation MUT-MAP, a high-sensitivity high-throughput microfluidics chip-based mutation analysis panel. PLoS One. 9 (3), e90761 (2014).
- Wong, S. Q., et al. Sequence artefacts in a prospective series of formalin-fixed tumours tested for mutations in hotspot regions by massively parallel sequencing. BMC Med Genomics. 7, 23 (2014).
- Narayan, A., et al. Ultrasensitive measurement of hotspot mutations in tumor DNA in blood using error-suppressed multiplexed deep sequencing. Cancer Res. 72 (14), 3492-3498 (2012).
- Hagemann, I. S., et al. Clinical next-generation sequencing in patients with non-small cell lung cancer. Cancer. 121 (4), 631-639 (2015).
- Won, H. H., Scott, S. N., Brannon, A. R., Shah, R. H., Berger, M. F. Detecting somatic genetic alterations in tumor specimens by exon capture and massively parallel sequencing. J Vis Exp. (80), e50710 (2013).
- Simen, B. B., et al. Validation of a next-generation-sequencing cancer panel for use in the clinical laboratory. Arch Pathol Lab Med. 139 (4), 508-517 (2015).
