En fenotip Karakterizasyonu: Niceleme Matters Neden<em> Drosophila</em> Larva Nöromüsküler Junction
Summary
Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.
Abstract
morfolojilerinden üzerinde çalışmaların çoğu belirli genler ve genetik yolların bozulması nasıl etkilendiğini anatomik özelliklerin niteliksel açıklamaları güveniyor. Genetik manipülasyon fenotipik etkilerin bir dizi üretmek ve varyasyonların da kontrol grubu içindeki bireyler arasında görülen, ancak nicel Tanımlar nadiren yapılır. delil Yükselen morfolojisi, boyut ve organellerin konumu hücre fonksiyonu ve sağkalım daha önce underappreciated, henüz temel bir rol oynadığını göstermektedir. Burada Drosophila larva nöromüsküler bileşke (NMJ) de fenotipleri kantitatif analizleri gerçekleştirmek için adım adım yönergeler sağlar. Biz biyo-görüntüleme teknikleri ve morfometrik spesifik hücresel süreçlere genetik mutasyonların etkilerini incelemek için analizler ile birlikte birçok güvenilir immunohistokimyasal işaretleri kullanmak. Özellikle, morfoloji, boyut ve n durumunu etkileyen fenotipleri nitel analiz odakuclei Drosophila larvaların çizgili kasların içinde. Drosophila larva NMJ sağlık ve hastalık hem yapısını ve kas sinir sistemi işlevini, altında yatan moleküler mekanizmaları araştırmak için değerli bir deneysel model. Bununla birlikte, burada tarif yöntemleri gibi diğer sistemlere uzatılabilir.
Introduction
Qualitative analysis restricts the focus of most experimental studies to the examination of genetic manipulations leading to large phenotypic effects or to phenotypes that are not amenable to quantification, e.g., absence/presence. Quantification of phenotypes is not usually performed and variations present within members of a phenotypic group are not taken into consideration. Additionally, without mathematical descriptions of morphologies, it may be difficult to determine whether fine scale phenotypic changes are the result of genetically induced alterations or whether observed changes are simply due to random fluctuations.
We propose that for an accurate and unbiased analysis of phenotypic defects due to gene disruption, quantitative methodologies should accompany more traditional qualitative approaches. Quantitative evaluation of phenotypes is particularly beneficial for structures such as synapses that present a high degree of variability due to their intrinsic morphological and functional plasticity. We have selected examples of quantitative analyses applied to areas of investigation with which we are most familiar, namely the Drosophila larval neuromuscular junctions (NMJs). However, concepts and principles apply equally well to other experimental systems.
The larval NMJ is an excellent model system to study synaptic development and function because of the highly stereotyped nature of its structure. Each hemi-segment of the larval neuromuscular system contains 32 identifiable motor neurons forming synaptic contacts with their postsynaptic target muscle. Every hemi-segment also contains a fixed number of muscles visible as multinucleated fibers attached to the internal surface of the cuticle1. Another advantage of using the larval neuromuscular system is the power and versatility of Drosophila genetics that easily allows the generation of a number of mutant alleles and the possibility to modify gene expression in a time- and tissue-restricted manner. Finally, 75% of the human genes causing a disease have an evolutionarily conserved orthologue in Drosophila2. Indeed, entire genetic pathways are conserved between flies and humans. Because of this, the Drosophila larval neuromuscular system is a very popular experimental model to elucidate the molecular mechanisms underlying a number of human diseases including amyotrophic lateral sclerosis (ALS)1.
Here we show that the availability of several reliable immuno-histochemical markers, combined with bio-imaging techniques and accurate morphometric analyses can describe anatomical traits that are likely to play an important functional role3,4,5. Among the cellular processes that are amenable to quantitative analyses, we focus on changes in shape, size and position of intracellular structures such as the nuclei. All these are processes that we know very little about.
The challenge for molecular geneticists in the coming decades will be to extend our current knowledge by analyzing the effect of genetic mutations that produce very subtle phenotypic defects. Quantitative methodologies that allow researchers to meticulously explore the effects of genetic mutations can provide a more comprehensive understanding of how genotypes relate to phenotypes, especially for poorly understood cellular processes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Geçmişte, içinde ve deney grupları arasında morfolojik farklılıklar nadiren dikkate alınmıştır. Ancak, nicel yöntemlerin uygulanması artık morfolojisi ve anatomik formları matematiksel tanımı karşılaştırmalı çalışmalar norm hesaplanır haline gelmektedir. kantitatif kullanımı belirli hücresel süreçleri üzerinde genetik manipülasyon etkilerini değerlendirirken analizleri, morfolojik değişiklikleri saptamak için kabiliyetinin artırılması ve bu değişiklikler açıklanan hangi ile doğruluğunu artıran umut tutun. Ayrıca, nicel verilerin istatistiksel analizi bize fenotipleri arasında gözlenen farklılıkların anlamlı olup olmadığını değerlendirmek için izin verir.
çizgili kaslarda, çekirdeklerin ayrı bir yuvarlak yapı sergiler ve eşit kas lifi boyunca dağıtılır. kurulması ve boyut, şekil ve çekirdeklerin mimarisini koruyarak moleküler mekanizmalar bilinmemekle birlikte, bu nükleer özellikler muhtemel t vardıro kas fonksiyonunu kontrol edilmesinde temel bir rol oynar. Nitekim, birkaç Miyopatiler kasların içinde çekirdeklerin morfoloji ve konumunu düzenleyen genlerdeki mutasyonların neden olur. şekil ve bir hücre içinde çekirdeklerin dağılım fonksiyonel önemi kas ile sınırlı değildir. Giderek artan kanıtlar, nükleer kusurlar da Parkinson hastalığı gibi nörodejeneratif hastalıkların 18,24 ile ilişkili olduğunu göstermektedir. Ayrıca, bu morfoloji, boyut ve endoplazmik retikulum ve fonksiyonel sonuçlar doğurabilir mitokondri dahil olmak üzere diğer organellerin hücre içi dağıtımını takdir başlıyor. Örneğin, mitokondriyal morfolojisi değişiklikler gibi optik atrofi tip-1 (OPA1) ve Charcot-Marie-Tooth tip 2A nöropati 25 gibi nörolojik bozukluklar ile ilişkili.
Bu önemli süreçleri altında yatan moleküler mekanizmaların sürecinde yardımcı olmak için, biz yüksek çözünürlüklü konfokal birleştirmek için teklifgörüntüleme yazılımı ve morfometrik veri nicel genetik manipülasyonlar kas liflerinin içinde çekirdeklerin şekil, boyut ve konumunu nasıl etkileyebileceğini değerlendirmek için analiz eder. Drosophila larvaları nöromüsküler sistemin son derece basmakalıp doğa ile güç ve birlikte Drosophila genetiği çok yönlülüğü Larvaların NMJ analizler bu tür için özellikle uygun bir deneysel model olun. Larva NMJs, fenotipik analizi NMJs bir sayıda aynı sinek içinde incelenebilir ve hatta aynı tanımlanabilir NMJ farklı genotipler 3,4 sinekler arasında karşılaştırılabilir doğru bir morfometrik sağlayan tek bir sinaps çözünürlükte gerçekleştirilebilir.
Drosophila larva NMJ nükleer pozisyon, şekil ve boyut Fenotipik karakterizasyon kaslarının içinde kasları ve çekirdekler vurgulamak antikorlar ile disseke NMJs immün gerçekleştirerek başlar. Protokolde Thi özetlenenödevi, myonuclei bütün kas leke DVAP özel çekirdek iç ve sahip antikorlar vurgulama nükleer işaretleyici ile, lamin, çekirdek zarfına bir göstergesi karşı poliklonal antikorlar ile lekelendi. Bu deneylerde kullanılan lamin antikorlar nazik Paul Fisher 19-22 temin edilmiştir, ancak anti-lamin antikorların alternatif kaynaklar kullanılabilir. Buna ek olarak, çekirdek zarfı için özel diğer antikorlar bir takım ticari olarak temin edilebilir. kasları, anti-aktin ya da anti-tubulin antikor ile boyanarak görünür olabilir süre Son olarak, DAPI ve propidyum iyodür nükleer belirteçler de mevcuttur. Bu deneysel prosedürde kullanılan dışındaki antikorlar kullanılırsa, immün protokol sabitleme koşulları ve yeni antikorlar için çalışan konsantrasyonları optimize edilmesi gerekecektir ekstra-adımlar gerektirir. hacim render analiz edilmesi gerekir, özellikle bu protokol, bir kritik adım, the slaytta numunelerin montajı. Bu durumda, slayt ve örnekler ezilmiş değildir, böylece lamel arasında aralayıcılar dahil etmek çok önemlidir. lamel her iki sürgünün sarılı selüloz bandı üç bant ara parçalar yapmak için kolay bir yol göstermektedir.
ImageJ 2D görüntüleri için kullanılan iken, 3D çok kanallı görüntü çoğu bu makalede sunulan analizleri, çünkü onun içi durumu Imaris kullanılarak yapılmıştır. Bununla birlikte, herhangi bir diğer benzer ticari yazılım paketi bu uygulamalar için de kullanılabilir.
Konfokal görüntüleri analiz için kullanılabilir (örneğin, ImageJ, CellProfiler, Vaa3D, Icy, KNIME ve diğerleri için) birçok açık kaynak ve ticari yazılım platformları bulunmaktadır. ImageJ 26, Fiji 27 olarak bilinen NIH ya da daha gelişmiş versiyonu ücretsiz yazılım, dünya çapında görüntüleme haberleşme için kullanılabilir ithalat filtreleri, makro ve eklentileri çok sayıda varty. Bu eklentileri çoğu bir dilim-dilim yan şekilde bilgi işlem odaklandık. Çok kanallı 3D görüntülerin görüntülenmesi ve analiz için uygun eklentiler vardır. Ancak, genellikle belirli bir görev için tasarlanmış ve kullanıcıların kendi ihtiyaçlarına bu eklentileri uzatmak veya uyarlamak gerekebilir. Öte yandan, ticari platformlar nispeten deneyimsiz kullanıcıları hedef ve genellikle inanılmaz bir hızla görüntü işleme görevleri kolaylığı kullanımı, geniş kapsama odaklandık.
Bu protokolde belirtilen nicel fenotipik analizi ile birlikte deneysel prosedür, organel morfolojisi ve hücre içindeki dağılımını kontrol moleküler mekanizmaların yardımcı olabilir. Ancak, bu yaklaşım, belirli bir uç noktada bu süreçleri analiz bariz bir sınırlama vardır. morfoloji ve organellerin dağılımı kontrol süreci çok dinamik olması ve sadece farklı hücre ty arasında değişmektedir muhtemelengelişimsel ya da fizyolojik durumuna bağlı olarak aynı hücre içinde pes değil, aynı zamanda. Bu analizin bir başka uygulama organel morfolojisi ve pozisyon değişiklikleri zamanla izlenecek izin zaman atlamalı görüntüleme ile temsil edilecektir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to Dr. Andrea Chai for her insightful comments on the manuscript. This work was supported by the Wellcome Trust (grant number: Pennetta8920) and by the Motor Neuron Disease Association (grant number: Pennetta6231).
Materials
| Micro-Forceps 0.3×0.25 mm | Fine Science Tools | 11030-12 | |
| Sylgard dissection plates | SIGMA-ALDRICH | 76103 | Mix the pre-weighed elastomer base with curing agent. Poor the mixture into a 5 cm Petri dish. Let cure it at 60ºC for at least 24 hours |
| Stainless/Steel Minutien Pins 0.1 mm diameter | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Microdissection scissors (ultra-fine) | Fine Science Tools | 15200-00 | |
| 1x PBS (Phosphate Buffered Saline). Composition: 3mM NaH2PO4, 7mM Na2HPO4, 130mM NaCl, pH 7 | NaH2PO4 (SIGMA-S8282), Na2HPO4 (SIGMA-S7907), NaCl (SIGMA-S7653) | ||
| Bouin's Solution. Composition: Picric Acid, Formaldehyde, Acetic Acid (15:10:1) | Picric Acid (SIGMA 197378), Formaldehyde (F8775), Acetic Acid (SIGMA-1005706) | ||
| 1x PBT (Phosphate Buffered Saline with Triton). 1xPBS +0.1% Triton | Triton-X100. SIGMA-T8787 | ||
| Normal Goat Serum | SIGMA | G9023 | |
| Guinea Pig anti-DVAP antibody | Provided by Dr. Giuseppa Pennetta (University of Edinburgh, UK). Use at !:200 dilution in 5% NGS | ||
| Rabbit anti-HRP (Horseradish peroxidase) | Jackson ImmunoResearch | 123-065-021 | Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS |
| Rabbit anti-Lamin antibody | Provided by Dr. Paul Fisher (State Univeristy of New York at Stony Brook). Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS | ||
| TO-PRO-3 | Molecular Probes | T3605 | |
| Goat anti-rabbit antibody, Alexa Fluor488, conjugated | Jackson ImmunoResearch | bs-295G-A555-BSS | Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS |
| Goat anti-guinea pig IgG antibody, Cy3, conjugated | Jackson ImmunoResearch | bs-0358G-Cy3-BSS | Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS |
| Vectashield mounting medium for fluorescence | Vector laboratories | H-1000 |
References
- Collins, C. A., DiAntonio, A. Synaptic development: insights from Drosophila. Curr. Opin. Neurobiol. 17 (1), 35-42 (2007).
- Fortini, M. E., Skupski, M. P., Boguski, M. S., Hariharan, I. K. A survey of human disease gene counterparts in the Drosophila genome. J. Cell Biol. 150 (2), 23-30 (2000).
- Ramachandran, P., Budnik, V. Dissection of Drosophila larval body-wall muscles. Cold Spring Harb Protoc. (8), (2010).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. JoVE. (24), (2009).
- Brent, J., Werner, K., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ immunohistochemistry. JoVE. (25), (2009).
- Ramachandran, P., Budnik, V. Immunocytochemical staining of Drosophila larval body-wall muscles. Cold Spring Harb Protoc. (8), (2010).
- Ling, S. C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Converging mechanisms in ALS and FTD: disrupted RNA and protein homeostasis. Neuron. 79 (3), 416-438 (2013).
- Nishimura, A. L., et al. A mutation in the vesicle-trafficking protein VAPB causes late-onset spinal muscular atrophy and amyotrophic lateral sclerosis. Am J Hum Genet. 75 (5), 822-831 (2004).
- Chen, H. J., et al. Characterization of the properties of a novel mutation in VAPB in familial amyotrophic lateral sclerosis. J Biol Chem. 285 (51), 40266-40281 (2010).
- Funke, A. D., et al. The P56S mutation in the VAPB gene is not due to a single founder: the first European case. Clin Genet. 77 (3), 302-303 (2010).
- Millecamps, S., et al. SOD1,ANG,VAPB,TARDBP, and FUS mutations in familial amyotrophic lateral sclerosis: genotype-phenotype correlations. J Med. Genet. 47 (8), 554-560 (2010).
- Landers, J. E., et al. New VAPB deletion variant and exclusion of VAPB mutations in familial ALS. Neurology. 70 (14), 1179-1185 (2008).
- Van Blitterswijk, M., et al. VAPB and C9orf72 mutations in 1 familial amyotrophic lateral sclerosis patient. Neurobiol Aging. 33 (12), 2951-2954 (2012).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Budnik, V., et al. Regulation of synapse structure and function by the Drosophila tumor suppressor gene dlg. Neuron. 17 (4), 627-640 (1996).
- Sanhueza, M., Zechini, L., Gillespie, T., Pennetta, G. Gain-of-function mutations in the ALS8 causative gene VAPB have detrimental effects on neurons and muscles. Biol Open. 3 (1), 59-71 (2014).
- Worman, H. J., Ostlund, C., Wang, Y. Diseases of the nuclear envelope. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (2), a000760 (2010).
- Liu, G. H., et al. Progressive degeneration of human neural stem cells caused by pathogenic LRRK2. Nature. 491 (7425), 603-607 (2012).
- Pennetta, G., Hiesinger, P. R., Fabian-Fine, R., Meinertzhagen, I. A., Bellen, H. J. Drosophila VAP-33A directs bouton formation at neuromuscular junctions in a dosage-dependent manner. Neuron. 35 (2), 291-306 (2002).
- Fisher, P. A., Berrios, M., Blobel, G. Isolation and characterization of a proteinaceous subnuclear fraction composed of nuclear matrix, peripheral lamina, and nuclear pore complexes from embryos of Drosophila melanogaster. J Cell Biol. 92 (3), 674-686 (1982).
- Smith, D. E., Fisher, P. A. Identification, developmental regulation, and response to heat shock of two antigenically related forms of a major nuclear envelope protein in Drosophila embryos: application of an improved method for affinity purification of antibodies using polypeptides immobilized on nitrocellulose blots. J Cell Biol. 99 (1), 20-28 (1984).
- Smith, D. E., Gruenbaum, Y., Berrios, M., Fisher, P. A. Biosynthesis and interconversion of Drosophila nuclear lamin isoforms during normal growth and in response to heat shock. J Cell Biol. 105 (2), 771-790 (1987).
- Puckelwartz, M. J., et al. Disruption of nesprin-1 produces an Emery Dreifuss muscular dystrophy-like phenotype in mice. Hum Mol Genet. 18 (4), 607-620 (2009).
- Tsujikawa, M., Omori, Y., Biyanwila, J., Malicki, J. Mechanism of positioning the cell nucleus in vertebrate photoreceptors. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (37), 14819-14824 (2007).
- Westermann, B. Mitochondrial fusion and fission in cell life and death. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 872-884 (2010).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
