Een vereenvoudigde methode voor de Ultra-Low Density, Long-Term Primaire hippocampus Neuron Cultuur

Groeiende hippocampale neuronen onder in vitro omstandigheden maakt waarneming en experimentele manipulatie van deze neuronen die in vivo anders mogelijk niet. Deze experimentele benadering wordt veel gebruikt om neuronale mechanismen van groei, polariteit, neuriet specificatie, handel en subcellulaire lokalisatie van eiwitten, synapsvorming en functionele rijping ¹ onthullen. Deze in vitro gekweekte hippocampale neuronen, wanneer geoogst late embryonale fase, relatief zuiver (> 90%) glutamaterge cellen piramidale morfologie ^2. Omdat neuronen in een 2-D oppervlak werden gekweekt onder in vitro omstandigheden, maakt deze werkwijze het observeren, zoals live imaging of immunocytochemie (ICC) kleuring via één brandvlak ^3; of manipulaties, zoals de behandeling met geneesmiddelen en transfecties ^3-6. Wanneer ze groeien bij hoge dichtheid, neuronen hebben de neiging om hoge tarieven van de overleving als gevolg van hogere co hebbenncentrations uitgescheiden groeifactoren naast voedings steun van de groeimedia, en vanwege neuriet contact-afhankelijke mechanismen ^7. Echter, een lage dichtheid hippocampus neuronen zijn wenselijk voor morfologische studies, waarbij een individueel neuron in zijn geheel kan worden afgebeeld of gekleurd voor ICC-analyse. Lage dichtheid neuronen zijn moeilijk te handhaven in kweek door gebrek aan ondersteuning paracriene en dus vereisen vaak trofische ondersteuning van een gliale (typisch corticale astrocyten) voedsterlaag, die moet worden opgemaakt voor neuron cultuur ^2. Als co-gekweekt met een gliale cel voedsterlaag worden lage dichtheid neuronen gekweekt op dekglaasjes en vervolgens omgedraaid bovenop de glia laag, zodat het lage dichtheid neuronen en glia tegenover elkaar. Een kleine afgesloten ruimte tussen glia en neuronen wordt gecreëerd door het plaatsen van paraffine stippen op de hoeken van de dekglaasjes derhalve tot een 'sandwich' layout ^2,8,9. De lage dichtheid neuronen zal groeien wedurende de beperkte ruimte tussen glia en het dekglaasje, die een tolerante micro-omgeving met geconcentreerde factoren uitgescheiden door neuronen en glia creëert. Deze aanpak levert een lage dichtheid, volledig ontwikkeld neuronen die redelijk uit elkaar geplaatst zijn, dus het vergemakkelijken van etikettering ICC of live-imaging studies.

Een duidelijk nadeel van neuron-glia co-cultuur, afgezien van tijdrovend en moeizaam, is dat het voorkomt onderzoek neuron-specifieke of cel-autonome mechanismen. Hoewel dit systeem is veel minder complex dan in vivo zenuwweefsel, glia effect op neuron ontwikkeling door middel van uitgescheiden, nog-niet-helemaal-gedefinieerde factoren kunnen de experimenten ¹⁰ beschamen. Daarom is in experimenten die het onderzoek naar neuron specifieke mechanismen, gedefinieerd kweekomstandigheden die te verwijderen serum en gliacellen steunlaag nodig zijn nodig. Een eerdere studie heeft kunnen kweken lage concentraties van neuronen (~ 9000 cellen / ^cm2) met een eree dimensionale hydrogel matrix ^11. Omdat een relatief zuivere neuronale populatie kan worden gekweekt met hoge dichtheid onder serumvrije omstandigheden zonder glial steun Onze hypothese is dat ultra-lage dichtheid van hippocampale neuronen in serumvrij gedefinieerd kweekmedium worden gekweekt door co-kweken ze met hoge dichtheid neuronen, in een manier die analoog is aan de conventioneel aangenomen neuron-glia co-cultuur. Inderdaad, hoge dichtheid hippocampale neuron culturen in een "sandwich" configuratie zijn onlangs gebruikt om een klein aantal gespecialiseerde endocriene magnocellulaire neuronen ¹² ondersteunen.

Daarom kan co-kweek met hoge dichtheid neuronen mogelijk lage dichtheid neuronen trofische factoren ondersteuning die voldoende is om de overleving op lange termijn mogelijk ontvangen. Dit protocol van het kweken van ultra-lage dichtheid neuronen werd dus geformuleerd en gevalideerd. Het protocol kan worden uitgevoerd binnen een enkel experiment, door het bereiden van een hoge dichtheid (~ 250.000 cellen / ml) dispelde hippocampale neuronen, en dan het maken van een verdunning tot een dichtheid ~ 10.000 neuronen op / ml (~ 3000 neuronen / dekglaasje of ~ 2000 neuronen / cm ^2), die veel lager dan de meeste gerapporteerde lage dichtheid cultures ^{2,3,9 , 11,13.} Dit kweekomstandigheid is losjes aangeduid als "ultra-low density cultuur en worden met" lage dichtheid "onderling verwisselbaar. De hoge dichtheid neuronen uitgeplaat op poly-D-lysine beklede 24-putjesplaten; terwijl de lage dichtheid neuronen gezaaid op poly-D-lysine beklede 12-mm dekglaasjes die in een andere 24-wells plaat geplaatst. De dekglaasjes met hechtende lage dichtheid neuronen worden omgedraaid op de top van de hoge dichtheid neuronen 2 uur later nadat de neuronen zijn afgedaald en aan de dekglaasjes. Bovendien, in plaats van paraffinewas stippen op de dekglaasjes boven de hoge dichtheid laag neuron verhogen, werd een 18 G naald gebruikt om de bodem van de 24 well platen etsen met twee evenwijdige strepen. De resulterende DISPLAced, grenzend aan plastics zorgen voor een verhoogde steun voor de dekglaasjes. Deze ruimte wordt consequent gemeten bij 150-200 urn, die voldoende zuurstof en kweekmedium uitwisseling mogelijk maakt, terwijl een micro-omgeving met geconcentreerd trofische factoren. Onder deze voorwaarde, de lage dichtheid neuronen groeien op grote schaal, en kan overleven dan drie maanden in de cultuur. Wanneer deze neuronen worden getransfecteerd met GFP plasmide na drie weken in cultuur worden de dendrieten rijkelijk bezaaid met dendritische stekels. Als bewijs van principe worden gegevens die aantonen dat deze co-kweeksysteem ondersteunt ultralage dichtheid kweken van hippocampale neuronen gezaaid op poly-D-lysine micro-eilanden, waarbij neuronen vormen autaptic verbindingen die onderzoek cel kan vergemakkelijken -autonomous, netwerk-onafhankelijke mechanismen.