Высокочувствительного анализа для измерения ареновирус-клеток Вложение

Аренавирусов представляют собой семейство оболочечных, одноцепочечных РНК -содержащих вирусов, которые обслуживаются в первую очередь у грызунов в природе ^1-3. В то время как эти вирусы , как правило , устанавливают бессимптомное, хроническую инфекцию в грызунах водохранилищах ^1,2, они могут вызвать серьезные заболевания у людей ^3. Важные патогенные виды включают вирус New World Хунин (JUNV) ⁴ и вирус Ласса Старого Света ^5, которые являются этиологическими агентами аргентинской геморрагической лихорадки в Южной Америке и лихорадки Ласса в Африке, соответственно. Лимфоцитарный вирус хореоменингита (LCMV), то прототипичный вирус семейства ^6, имеет распространение во всем мире и отвечает за множества болезненных состояний , включая асептического менингита у иммунокомпетентных лиц ^6, тяжелых врожденных дефектов развития плода ⁷ или высокой летальностью иммунодефицитом лица , следующие твердых трансплантации органов. ^8,9 Отсутствие Соединенных ШтатовПищевых продуктов и медикаментов (FDA) вакцины или обсуждения и эффективные противовирусные средства для борьбы с этими вирусами подчеркивает острую необходимость в разработке новых стратегий терапевтически предназначаться для этих новых / повторно возникающих патогенных микроорганизмов.

Ареновирус геном состоит из двух одноцепочечных РНК – сегментов, большой (L) (~ 7,2 кб) и малых (S) (~ 3,6 кб) сегментов ^10. Сегмент S кодирует вирусный нуклеопротеид (NP) и гликопротеин оболочки (GP) а сегмент L кодирует вирусной полимеразы (L) и матричный белок (Z). L и S геномные сегменты РНК (vRNAs) упакованы в вирионы ^10-12. Начальная стадия ареновирус инфекции является прикрепление вирусных частиц к клеткам – хозяевам , через взаимодействие между вирусным GP и ее соответствующими рецепторами клеток – хозяев , которые, для JUNV, включающего человеческий рецептор трансферрина 1 (hTfR1) ^13,14. После присоединения частицы JUNV взяты в клетку с помощью клатрин-эндоцитоза ^15.Частицы затем трафика на поздних эндосом , где низкое значение рН этого отделения вызывает активацию GP ^16,17. После активации GP-кодируемого слитого пептидные вставки в эндосомный мембраны, инициируя слияние между вирусными и эндосомальных мембран. Успешные результаты слияния в выпуске вириона упакованной vRNAs в цитоплазму, где они служат в качестве шаблонов для геномной репликации и транскрипции. Когда достаточное количество вирусных структурных белков и vRNAs образуются новые частицы собираться и бутон из инфицированной клетки , чтобы завершить жизненный цикл ^18.

Для того, чтобы облегчить открытие новых стратегий для терапевтических целевых патогенных аренавирусов, наша группа была сосредоточена на выявлении факторов-хозяев, которые имеют решающее значение для распространения вируса, но необязательны для хозяина. В этом контексте, определяя точную стадию (и) жизненного цикла вируса под контролем таких факторов хозяина необходимо направлятьразработка противовирусных стратегий. Здесь мы опишем количественный (Q) ОТ-ПЦР-анализ , который может быть использован для измерения прикрепление ареновирус-клеток с целью идентификации влияют ли определенные белки , принимающие и / или противовирусные молекулы этой начальной стадии проникновения вируса ^19. Альтернативные подходы к оценке вложения ареновирус-клеток фигурируют вирионов , меченные биотином ^20, флуоресцентных красителей ²¹ или радиоактивных изотопов ^22. Недостатками этих методов может включать требование больших количеств вируса ввода (например , высокая кратностью инфекции (MOI)), использование радиоактивности и / или дополнительных шагов обработки для подготовки ввода вируса (например , концентрацию и / или маркировки вируса) , В частности, использование высокой MOI делает его трудно отличить производительным по сравнению с непроизводственных вложений событий ^15,23. QRT-PCR на основе анализа, описанную здесь можно обнаружить крепления события, используя всего лишь 20 зубной налет дляMing единиц (Pfus) вируса, который переводит в МВД 0,0004 для 48-луночного планшета. Таким образом, сильная чувствительность анализа преодолевает требование высокой MOI, а также любые вирусы маркировки или концентрации шагов. Кроме того, анализ может быть я), предназначенный для измерения вириона эндоцитоз, а также высвобождение вирусного генома в цитоплазму следующие слияния и II) специально для использования с другими вирусами через развитие вирус-специфических QRT-реагентов для ПЦР (примеры см ^24-27).