Ensaio altamente sensível para a medição do Anexo de células Arenavirus

Arenavírus são uma família de vírus com envelope, de ARN de cadeia simples que são mantidas essencialmente em roedores na natureza ^1-3. Embora estes vírus tipicamente estabelecer uma infecção assintomática, persistente em reservatórios de roedores ^1,2, que pode causar doença grave em humanos ^3. Espécies patogênicas importantes incluem o vírus Novo Mundo Junin (JUNV) ⁴ e o vírus Old Lassa Mundial ^5, que são os agentes etiológicos da febre hemorrágica argentina na América do Sul e da febre de Lassa na África, respectivamente. Vírus da coriomeningite linfocítica (LCMV), o vírus protótipo da família ^6, tem uma distribuição mundial e é responsável por uma variedade de doenças, incluindo meningite asséptica em indivíduos imunocompetentes ^6, defeitos congênitos graves no feto em desenvolvimento ^7, ou de alta letalidade em imunossuprimidas indivíduos na sequência de órgãos sólidos transplante ^8,9. A falta de Estados UnidosFood and Drug Administration (FDA) -aprovado vacinas ou medicamentos antivirais eficazes para combater estes vírus destaca a necessidade crítica de desenvolver novas estratégias para atingir terapeuticamente esses patógenos emergentes / re-emergente.

O genoma arenavírus consiste em dois segmentos de ARN de cadeia simples, a grande (L) (~ 7,2 kb) e pequena (s) (~ 3,6 kb) segmentos ^10. O segmento S codifica a nucleoproteína viral (NP) e a glicoproteína do envelope (GP), enquanto o segmento L codifica a polimerase viral (L) e proteína de matriz (Z). O L e segmentos de ARN genómico S (ARNv) são empacotados em viriões ^10-12. O passo inicial de infecção arenavírus é a ligação de partículas virais às células hospedeiras através de uma interacção entre o GP viral e os seus receptores de células hospedeiras correspondentes que, por JUNV, inclui o receptor de transferrina humana 1 (hTfR1) ^13,14. Após a ligação, as partículas JUNV são levados para dentro da célula através de endocitose mediada por clatrina ^15.Partículas de tráfego, em seguida, para o final do endossoma onde a baixo pH deste compartimento desencadeia a activação da GP ^16,17. Uma vez activadas, as inserções de péptidos de fusão codificada-GP na membrana endossomal, iniciando a fusão entre as membranas viral e endossomais. resultados da fusão de sucesso na liberação dos vRNAs embalados-virion no citoplasma, onde servem como modelos para replicação genômica e transcrição. Quando uma quantidade suficiente de proteínas estruturais virais e ARNv são gerados, novas partículas de montar e botão da célula infectada para completar o ciclo de vida ^{de 18 anos.}

Para facilitar a descoberta de novas estratégias para atingir terapeuticamente os arenavírus patogênicos, o nosso grupo tem-se centrado na identificação de factores do hospedeiro que são críticas para a propagação de vírus, mas dispensável para o anfitrião. Neste contexto, a definição do estádio preciso (s) do ciclo de vida viral controlada por esses factores do hospedeiro é necessária para guiar odesenvolvimento de estratégias antivirais. Aqui, nós descrevemos um (Q) ensaio quantitativo com base em RT-PCR que podem ser utilizados para medir a ligação de células arenavírus para o propósito de identificar se as proteínas hospedeiras seleccionadas e / ou moléculas antivirais influenciar esta fase inicial da entrada viral ^19. Abordagens alternativas para medir a fixação de células arenavírus têm caracterizado viriões marcados com biotina ^20, corantes fluorescentes ^21, ou isótopos radioactivos ^22. Inconvenientes para estes métodos podem incluir o requisito de grandes quantidades de vírus de entrada (por exemplo, elevadas multiplicidades de infecção (MOI)), a utilização de radioactividade, e / ou passos adicionais de manuseamento para a preparação do vírus de entrada (por exemplo, concentração e / ou a rotulagem de vírus) . Em particular, o uso de alta MOI torna difícil distinguir produtivo contra eventos de fixação não produtivas ^15,23. O ensaio à base de qRT-PCR descrito aqui pode detectar eventos de ligação utilizando tão pouco quanto 20 por placaunidades Ming (PFU) de vírus, que se traduz em um MOI de 0,0004 para uma placa de 48 poços. Portanto, a forte sensibilidade do ensaio supera a necessidade de alta MOI assim como quaisquer passos de rotulagem ou de vírus de concentração. Além disso, o ensaio pode ser i) adaptado para medir virião endocitose, bem como libertação de genoma do vírus no citoplasma da seguinte fusão e ii) adaptado para utilização com outros vírus através do desenvolvimento de reagentes de qRT-PCR específica para o vírus (para exemplos, ver ^24-27).