アレナウイルス - 細胞付着の測定のための高感度アッセイ

アレナウイルスは、自然界^1-3のげっ歯類で主に維持されている包まれ、一本鎖RNAウイルスのファミリーです。これらのウイルスは、通常、齧歯類貯水池^1,2に無症候性、持続感染を確立しているが、それらは、ヒト³に重篤な疾患を引き起こす可能性があります。重要な病原性の種は、新世界フニンウイルス^（JUNV）4とそれぞれアルゼンチン南米出血熱、アフリカのラッサ熱の病因剤である旧世界ラッサウイルス^5が含まれます。リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（LCMV）、家族⁶の原型ウイルスは、世界的な分布を持っており、免疫抑制における免疫応答性個体⁶で無菌性髄膜炎、胎児⁷に重篤な先天性欠損、または高い致死率を含む種々の疾患状態の原因であります固形臓器移植^8,9を以下の個人。米国の欠如これらのウイルスに対抗するための食品医薬品局（FDA）が承認したワクチンや有効な抗ウイルス薬は、治療これらの新興/再新興病原体を標的とする新たな戦略を開発するための重要な必要性を強調しています。

アレナウイルスのゲノムは、2つの一本鎖RNAセグメント、大（L）（〜7.2キロバイト）と小（S）（〜3.6キロバイト）セグメント¹⁰から構成されています。 Lセグメントはウイルスポリメラーゼ（L）、およびマトリックスタンパク質（Z）をコードしながら、Sセグメントはウイルス核タンパク質（NP）およびエンベロープ糖タンパク質（GP）をコードします。 LとSのゲノムRNAセグメント（のvRNA）は、ビリオン^10-12にパッケージ化されています。アレナウイルス感染の初期段階は、ウイルス粒子の付着はJUNVのために、ヒトトランスフェリン受容体^{1（hTfR1）13,14を}含み、ウイルスGPとそれに対応する宿主細胞受容体との間の相互作用を介して細胞をホストすることです。添付ファイルの後、JUNV粒子はクラスリン依存性エンドサイトーシス^15を介して細胞内に取り込まれます。その後、粒子このコンパートメントの低pHはGP ^16,17の活性化を誘発後期エンドソームへのトラフィック。いったんウイルスおよびエンドソーム膜の融合を開始し、エンドソーム膜に、GP-コードされる融合ペプチド挿入を活性化しました。彼らは、ゲノムの複製および転写のための鋳型としての役割を果たす細胞質内へのビリオンにパッケージのvRNAのリリースで成功融合結果。ウイルス構造タンパク質とのvRNAの十分な量が生成されると、新しい粒子がライフサイクル^18を完了するために感染細胞からアセンブルし芽。

治療的に病原性アレナウイルスを標的とするために新たな戦略の発見を容易にするために、当社グループは、ホスト用のウイルス増殖のために重要な、しかし必須では宿主因子の同定に焦点を当ててきました。この文脈において、そのような宿主因子によって制御されるウイルスのライフサイクルの正確なステージ（複数可）を定義する案内することが必要です抗ウイルス戦略の開発。ここで、我々は、選択された宿主タンパク質および/ ​​または抗ウイルス性分子がウイルス侵入¹⁹のこの初期の段階に影響を与えるかどうかを識別するためにアレナウイルス-細胞接着を測定するために使用することができる定量的（q）はRT-PCRに基づくアッセイを記載します。アレナウイルス-細胞付着を測定するための別のアプローチは、ビオチン²⁰で標識されたビリオン、蛍光染料^21、または放射性同位元素^22を特色^にしています。これらの方法の欠点は、入力されたウイルスの大量の要求（感染の例えば、高多重度（MOI））、放射能の使用、および/ ​​または入力ウイルスを調製するための追加の処理工程（ 例えば、濃度および/ ​​またはウイルスの標識）を含むことができます。特に、高いMOIを用いることが困難な非生産添付イベント^15,23対生産性を区別することができます。ここに記載のqRT-PCRに基づくアッセイは、20プラークとしていくつかを使用して、添付イベントを検出することができます。48ウェルプレートのために0.0004のMOIに変換ウイルスの明単位（PFUの）、。したがって、アッセイの強い感度が高いMOIの要件だけでなく、任意のウイルス標識または濃縮工程を克服します。さらに、アッセイは、ⅰ）融合後のビリオンのエンドサイトーシスと同様に細胞質へのウイルスゲノムの放出を測定するように構成することができると、ii）参照、例のために（ウイルス特異的定量RT-PCR試薬の開発を通じて、他のウイルスで使用するために仕立て^24-27）。