Saggio altamente sensibile per la misura dell'attaccamento Arenavirus-cell

Arenavirus sono una famiglia di avvolgeva, virus a RNA a singolo filamento che si mantengono prevalentemente nei roditori in natura ^1-3. Mentre questi virus in genere stabiliscono un asintomatica, infezione persistente in serbatoi roditori ^1,2, possono causare gravi malattie negli esseri umani ^3. Specie patogene importanti includono il virus Nuovo Mondo Junin (JUNV) ⁴ e il virus Vecchio Mondo Lassa ^5, che sono gli agenti eziologici di febbre emorragica argentina in Sud America e febbre di Lassa in Africa, rispettivamente. Virus Coriomeningite linfocitaria (LCMV), il virus prototipo della famiglia ^6, ha una distribuzione a livello mondiale ed è responsabile di una varietà di stati patologici tra cui la meningite asettica nei soggetti immunocompetenti ^6, gravi difetti di nascita nel feto in via di sviluppo ^7, o ad alta letalità in immunodepressi individui a seguito solido-trapianto di organi ^8,9. La mancanza di Stati UnitiFood and Drug Administration (FDA) -approvato vaccini o farmaci antivirali efficaci per combattere questi virus mette in evidenza la necessità critica di sviluppare nuove strategie per indirizzare terapeuticamente questi patogeni emergenti / ri-emergente.

Il genoma Arenavirus si compone di due segmenti a singolo filamento di RNA, la grande (L) (~ 7,2 kb) e piccolo (S) (~ 3,6 kb) segmenti di ^10. Il segmento S codifica la nucleoproteina virale (NP) e glicoproteina busta (GP) mentre il segmento L codifica la polimerasi virale (L) e la proteina della matrice (Z). La L e segmenti di RNA genomici S (vRNAs) sono confezionati in virioni ^10-12. Il primo passo di infezione Arenavirus è l'attaccamento di particelle virali per ospitare cellule attraverso una interazione tra il GP virale e le sue corrispondenti recettori della cellula ospite, che, per JUNV, comprende il recettore umano transferrina 1 (hTfR1) ^13,14. A seguito di attaccamento, le particelle JUNV sono presi nella cella via clatrina mediata endocitosi ^15.Le particelle quindi il traffico al fine endosome dove il basso pH di questo comparto determinerà l'attivazione della GP ^16,17. Una volta attivato, gli inserti peptide di fusione GP-codificato nella membrana endosomal, avviando la fusione tra le membrane virali e endosomali. risultati di fusione di successo nel rilascio delle vRNAs virione-confezionati nel citoplasma, dove servono come modelli per la replicazione e la trascrizione genomica. Quando vengono generati una quantità sufficiente di proteine ​​strutturali virali e vRNAs, nuove particelle assemblare e gemma dalla cellula infettata per completare il ciclo di vita ^18.

Per facilitare la scoperta di nuove strategie per indirizzare le terapeuticamente arenavirus patogeni, il nostro gruppo si è concentrata sull'identificazione di fattori dell'ospite che sono fondamentali per la propagazione del virus, ma indispensabili per l'host. In questo contesto, definendo la fase precisa (s) del ciclo di vita virale controllata da tali fattori dell'ospite è necessario guidare lasviluppo di strategie antivirali. Qui, descriviamo un (q) saggio RT-PCR-based che può essere utilizzato per misurare allegato Arenavirus cellule al fine di identificare se le proteine ​​ospitanti selezionate e / o molecole antivirali influenzano questa fase iniziale di ingresso del virus ^19. Approcci alternativi per misurare l'attaccamento Arenavirus cellule hanno caratterizzato virioni etichettati con biotina ^20, coloranti fluorescenti ^21, o isotopi radioattivi ^22. Inconvenienti di questi metodi possono includere il requisito per grandi quantità di virus in ingresso (ad esempio elevati molteplicità di infezione (MOI)), l'uso di radioattività, e / o fasi di manipolazione aggiuntivi per preparare virus in ingresso (ad esempio, concentrazione e / o l'etichettatura del virus) . In particolare, l'uso di alta MOI rende difficile distinguere produttiva rispetto eventi di fissaggio non produttive ^15,23. Il saggio qRT-PCR-based descritto qui in grado di rilevare gli eventi di attacco utilizzando come pochi come 20 placca perunità Ming (PFUs) di virus, che si traduce in un MOI di 0,0004 per un piatto 48 pozzetti. Pertanto, la forte sensibilità del saggio supera il requisito per alta MOI nonché eventuali operazioni di etichettatura virus o di concentrazione. Inoltre, il test può essere i) atto a misurare virione endocitosi, nonché rilascio di genoma del virus nel citoplasma in seguito alla fusione e ii) su misura per l'utilizzo con altri virus attraverso lo sviluppo di reagenti qRT-PCR virus-specifici (per esempio, vedere ^24-27).