Assay הרגיש ביותר למדידה של Attachment Arenavirus התאים
Summary
The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. We report a quantitative (q)RT-PCR-based assay for ultrasensitive detection and quantitation of arenavirus attachment events.
Abstract
Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. While virus-cell attachment can be measured through the use of virions labeled with biotin, radioactive isotopes, or fluorescent dyes, these approaches typically require high multiplicities of infection (MOI) to enable detection of bound virus. We describe a quantitative (q)RT-PCR-based assay that measures Junin virus strain Candid 1 attachment via quantitation of virion-packaged viral genomic RNA. This assay has several advantages including its extreme sensitivity and ability to measure attachment over a large dynamic range of MOIs without the need to purify or label input virus. Importantly, this approach can be easily tailored for use with other viruses through the use of virus-specific qRT-PCR reagents. Further, this assay can be modified to permit measurement of particle endocytosis and genome uncoating. In conclusion, we describe a simple, yet robust assay for highly sensitive measurement of arenavirus-cell attachment.
Introduction
Arenaviruses הם משפחה של מעטפת, וירוסים RNA חד-גדילי שנשמרים בעיקר במכרסמים בטבע 1-3. בעוד וירוסים אלה בדרך כלל להקים זיהום אסימפטומטית, עיקש במאגרי מכרסם 1,2, הם יכולים לגרום למחלות קשות בבני אדם 3. מיני פתוגניים חשובים לכלול את וירוס העולם החדש חונין (JUNV) 4 ואת העולם הישן לסה הווירוס 5, אשר הם סוכני האטיולוגי של קדחת מדממת ארגנטינית בדרום אמריקה קדחת לסה באפריקה, בהתאמה. וירוס choriomeningitis לימפוציטית (LCMV), וירוס אב הטיפוס של המשפחה 6, נפוץ ברחבי עולם ואחראי על מגוון של מצב מחלה כולל דלקת קרום מוח אצל אנשים עם מערכת חיסון תקין 6, למומים מולדים חמורים בעובר 7 מתפתח, או קטלנית גבוה immunosuppressed אנשים הבאים 8,9 השתלה מוצק איברים. חוסר ארצות הבריתמזון ותרופות (FDA) -approved חיסונים או antivirals היעילה להילחם וירוסים אלה מדגישים את הצורך הקריטי לפתח אסטרטגיות רומן למקד אלה מתעוררים / מחדש המתעוררים פתוגנים טיפוליים.
הגנום arenavirus מורכב משני המגזרים RNA חד-גדילי, גדול (L) (~ 7.2 kb) וקטנים (S) (~ 3.6 kb) מגזרי 10. מגזר S המקודד את nucleoprotein ויראלי (NP) ו גליקופרוטאין המעטפה (GP) בעוד קטע L מקודד פולימראז ויראלי (L) וחלבון מטריקס (Z). The L ומגזרי RNA S גנומי (vRNAs) ארוזים לתוך virions 10-12. השלב הראשוני של זיהום arenavirus הוא מצורף של חלקיקים נגיפיים לארח התאים דרך אינטראקציה בין GP ויראלי קולטני התא המארח המתאים אשר עבור JUNV, כולל קולטן transferrin האדם 1 (hTfR1) 13,14. בעקבות עיקול, חלקיקים JUNV נלקחים לתוך התא באמצעות אנדוציטוזה בתיווך clathrin 15.חלקיקים אז תנועה אל אנדוזום מאוחר שבו pH הנמוך של תא זה מעורר את ההפעלה של GP 16,17. לאחר ההפעלה, מוסיף פפטיד היתוך בקידוד GP לתוך קרום endosomal, ייזום היתוך בין ממברנות ויראלי endosomal. תוצאות היתוך מוצלחות שחרורו של vRNAs ארוז virion לתוך הציטופלסמה, שם הם משרתים כתבניות שכפולות שעתוק הגנומי. כאשר כמויות מספיקות של חלבונים מבניים ויראלי vRNAs נוצרות, חלקיקים חדשים להרכיב ניצן מהתא הנגוע כדי להשלים את מחזור החיים 18.
כדי להקל על גילוי האסטרטגיות חדשות כדי למקד את arenaviruses פתוגניים טיפולי, הקבוצה שלנו התמקדה בזיהוי גורמים מארחים כי הם קריטיים עבור התפשטות נגיף, אבל אפשר לוותר עליהן עבור המארחת. בהקשר זה, המגדיר את הבמה המדויקת (ים) של מחזור החיים של הנגיף נשלט על ידי גורמי מארח שכזו נדרשת בכדי להנחות אתפיתוח של אסטרטגיות נגיפים. בזאת, אנו מתארים assay כמותית (q) RT-PCR מבוסס כי ניתן להשתמש כדי למדוד מצורף arenavirus תאים לצורך זיהוי אם חלבונים מארחים נבחרים ו / או מולקולות אנטי להשפיע בשלב ראשוני זה של כניסה ויראלי 19. גישות חלופיות למדידת מצורף arenavirus תאים כיכבו virions שכותרתו עם ביוטין 20, צבעי ניאון 21, או איזוטופים רדיואקטיביים 22. חסרונות שיטות אלה יכולים לכלול את הדרישה עבור כמויות גדולות של וירוס קלט (למשל multiplicities גבוהה של זיהום (משרד פנים)), שימוש רדיואקטיביות, ו / או צעדי טיפול נוספים להכנת וירוס קלט (למשל ריכוז ו / או תיוג של וירוס) . בפרט, השימוש גבוה משרד פנים מקשה להבחין פרודוקטיבי לעומת אירועים מצורפים פרודוקטיבי 15,23. את assay qRT-PCR המבוסס המתואר כאן ניתן לזהות אירועים מצורפים באמצעות כמה כמו 20 פלאק עבוריחידות מינג (PFUs) של הנגיף, אשר מיתרגם משרד הפנים של 0.0004 עבור צלחת 48-היטב. לכן, הרגישות החזקה של assay מתגברת על הדרישה גבוהה משרד פנים וכן כל צעדי תיוג וירוס או ריכוז. יתר על כן, assay יכול להיות אני) מותאם למדוד אנדוציטוזה virion וכן שחרורו של הגנום וירוס לתוך הציטופלסמה הבא פיוז'ן ii) מותאם לשימוש עם וירוסים אחרים באמצעות הפיתוח של חומרים כימיים qRT-PCR ספציפי וירוס (לדוגמות, ראה 24-27).
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול אנו מתארים הוא פשוט וחזקים בתנאי השיקולים הקריטיים הבאים הם נצפו. ראשית, טכניקה מראש PCR קפדנית חייבת להיות מועסקת (ראה 28 לבחינה מעולה). זה הכרחי כי כל חומרים כימיים וציוד חופשיים של DNA מוגבר המכיל את רצף היעד qPCR וכי הבקרות המתאימות נמצאים במקום כדי לזהו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים מרקוס טאלי, נתן רועי, כריסטופר זיגלר, אמילי ברוס, ובנימין המלך לדיונים מועילים לבין המכון הלאומי לבריאות לתמיכה במחקרים אלה באמצעות מענקים T32 AI055402 (JK), R21 AI088059 (JB), ו P20RR021905 (JB) .
Materials
| DMEM | Life Technologies | 11965-118 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-163 | 100x |
| HEPES Buffer Solution | Life Technologies | 15630-130 | 100x |
| PBS pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | 1x |
| Vero E6 cells | American Type Culture Collection | CRL-1586 | |
| Costar 48-well plate | Corning | 3548 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74106 | do not mix buffers RLT or RW1 with bleach |
| QIAshredder homogenizer | Qiagen | 79654 | |
| Taqman Universal PCR Master Mix | Life Technologies | 4326614 | |
| Multiscribe Reverse Transcriptase (50U/µl) | Life Technologies | 4311235 | |
| dNTP Mixture (10 mM; 2.5 mM each dNTP) | Life Technologies | N808-0260 | |
| GeneAmp 10X PCR Buffer II and 25 mM MgCl2 solution | Life Technologies | N808-0010 | |
| RNase Inhibitor (5000U/100 µl) | Life Technologies | N808-0119 | |
| RT primer 5’-AAGGGTTTAAAAATGGTAGCAGAC-3’ | Integrated DNA Technologies | 250 nmol DNA oligo | standard desalting |
| Forward qPCR primer 5’-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3’ | Life Technologies | 4304971 | standard desalting |
| Reverse qPCR primer 5’-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3’ | Life Technologies | 4304971 | standard desalting |
| TaqMan Probe 5’-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3’ | Life Technologies | 4316033 | HPLC purified |
| MicroAmp Fast Optical 96-well reaction plate (0.1 mL) | Life Technologies | 4346906 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Life Technologies | 4376598 | or other qPCR instrument |
References
- Childs, J. C., Peters, C. J., Salvato, M. S. . The Arenaviridae. , 331-373 (1993).
- Salazar-Bravo, J., Ruedas, L. A., Yates, T. L. Mammalian reservoirs of arenaviruses. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 262, 25-63 (2002).
- Buchmeier, M. J., de la Torre, J. C., Peters, C. J., Knipe, D. M., et al. Ch. 50. Fields Virology. 2, 1791-1827 (2007).
- Parodi, A. S., et al. Sobre la etiologia del brote epidemico de Junin (Nota previa). Dia Medico. 30, (1958).
- Frame, J. D., Baldwin, J. M., Gocke, D. J., Troup, J. M. Lassa fever, a new virus disease of man from West Africa. I. Clinical description and pathological findings. Am. J. Trop. Med. Hyg. 19, 670-676 (1970).
- Buchmeier, M. J., Zajac, A. J. . Lymphocytic Choriomenigitis Virus. , (1999).
- Barton, L. L., Mets, M. B., Beauchamp, C. L. Lymphocytic choriomeningitis virus: emerging fetal teratogen. Am. J. Obstet. Gynecol. 187, 1715-1716 (2002).
- Fischer, S. A., et al. Transmission of lymphocytic choriomeningitis virus by organ transplantation. N. Engl. J. Med. 354, 2235-2249 (2006).
- Palacios, G., et al. A new arenavirus in a cluster of fatal transplant-associated diseases. N. Engl. J. Med. 358, 991-998 (2008).
- Meyer, B. J., de la Torre, J. C., Southern, P. J. Arenaviruses: genomic RNAs, transcription, and replication. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 262, 139-157 (2002).
- Meyer, B. J., Southern, P. J. Sequence heterogeneity in the termini of lymphocytic choriomeningitis virus genomic and antigenomic RNAs. J. Virol. 68, 7659-7664 (1994).
- Haist, K., Ziegler, C., Botten, J. Strand-Specific Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay for Measurement of Arenavirus Genomic and Antigenomic RNAs. PLoS One. 10, e0120043 (2015).
- Radoshitzky, S. R., et al. Transferrin receptor 1 is a cellular receptor for New World haemorrhagic fever arenaviruses. Nature. 446, 92-96 (2007).
- Martinez, M. G., et al. Utilization of human DC-SIGN and L-SIGN for entry and infection of host cells by the New World arenavirus, Junin virus. Biochem. Biophys. Res. Commun. 441, 612-617 (2013).
- Martinez, M. G., Cordo, S. M., Candurra, N. A. Characterization of Junin arenavirus cell entry. J. Gen. Virol. 88, 1776-1784 (2007).
- Martinez, M. G., Forlenza, M. B., Candurra, N. A. Involvement of cellular proteins in Junin arenavirus entry. Biotechnol J. 4, 866-870 (2009).
- Nunberg, J. H., York, J. The Curious Case of Arenavirus Entry, and Its Inhibition. Viruses. 4, 83-101 (2012).
- Botten, J., King, B., Klaus, J., Zielger, C. . Viral Hemorrhagic Fevers. , 233-260 (2013).
- Klaus, J. P., et al. The intracellular cargo receptor ERGIC-53 is required for the production of infectious arenavirus, coronavirus, and filovirus particles. Cell Host Microbe. 14, 522-534 (2013).
- Rojek, J. M., Perez, M., Kunz, S. Cellular entry of lymphocytic choriomeningitis virus. J. Virol. 82, 1505-1517 (2008).
- Lavanya, M., Cuevas, C. D., Thomas, M., Cherry, S., Ross, S. R. siRNA screen for genes that affect Junin virus entry uncovers voltage-gated calcium channels as a therapeutic target. Sci Transl Med. 5, 204ra131 (2013).
- Ellenberg, P., Edreira, M., Scolaro, L. Resistance to superinfection of Vero cells persistently infected with Junin virus. Arch. Virol. 149, 507-522 (2004).
- Brandenburg, B., et al. Imaging poliovirus entry in live cells. PLoS Biol. 5, e183 (2007).
- Petersen, J., et al. The Major Cellular Sterol Regulatory Pathway Is Required for Andes Virus Infection. PLoS pathogens. 10, e1003911 (2014).
- Jonsson, N., Gullberg, M., Israelsson, S., Lindberg, A. M. A rapid and efficient method for studies of virus interaction at the host cell surface using enteroviruses and real-time PCR. Virol J. 6, 217 (2009).
- Jiang, J., et al. Hepatitis C virus attachment mediated by apolipoprotein E binding to cell surface heparan sulfate. J. Virol. 86, 7256-7267 (2012).
- Shannon-Lowe, C., et al. Epstein-Barr virus-induced B-cell transformation: quantitating events from virus binding to cell outgrowth. J. Gen. Virol. 86, 3009-3019 (2005).
- Mifflin, T. E. Setting up a PCR laboratory. CSH Protoc. 2007, pdb top14 (2007).
- Maiztegui, J. I., et al. Protective efficacy of a live attenuated vaccine against Argentine hemorrhagic fever. AHF Study Group. J. Infect. Dis. 177, 277-283 (1998).
- Goni, S. E., et al. Genomic features of attenuated Junin virus vaccine strain candidate. Virus Genes. 32, 37-41 (2006).
- Chosewood, L. C., Wilson, D. E. . Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. , (2009).
- White, J., Matlin, K., Helenius, A. Cell fusion by Semliki Forest, influenza, and vesicular stomatitis viruses. J. Cell Biol. 89, 674-679 (1981).
- McGraw, T. E., Greenfield, L., Maxfield, F. R. Functional expression of the human transferrin receptor cDNA in Chinese hamster ovary cells deficient in endogenous transferrin receptor. J. Cell Biol. 105, 207-214 (1987).
- Borrow, P., Oldstone, M. B. Characterization of lymphocytic choriomeningitis virus-binding protein(s): a candidate cellular receptor for the virus. J. Virol. 66, 7270-7281 (1992).
- Rojek, J. M., Spiropoulou, C. F., Kunz, S. Characterization of the cellular receptors for the South American hemorrhagic fever viruses Junin, Guanarito, and Machupo. 346. , 476-491 (2006).
- Helguera, G., et al. An antibody recognizing the apical domain of human transferrin receptor 1 efficiently inhibits the entry of all new world hemorrhagic Fever arenaviruses. J. Virol. 86, 4024-4028 (2012).
- Sanchez, A., et al. Junin virus monoclonal antibodies: characterization and cross-reactivity with other arenaviruses. J. Gen. Virol. 70, 1125-1132 (1989).
- Trombley, A. R., et al. Comprehensive panel of real-time TaqMan polymerase chain reaction assays for detection and absolute quantification of filoviruses, arenaviruses, and New World hantaviruses. Am. J. Trop. Med. Hyg. 82, 954-960 (2010).
- Helenius, A., Marsh, M., White, J. Inhibition of Semliki forest virus penetration by lysosomotropic weak bases. J. Gen. Virol. 58 (Pt 1), 47-61 (1982).
- Nour, A. M., Li, Y., Wolenski, J., Modis, Y. Viral membrane fusion and nucleocapsid delivery into the cytoplasm are distinct events in some flaviviruses. PLoS pathogens. 9, e1003585 (2013).
