Hochempfindliches Verfahren zur Messung von Arenavirus-Zell-Anlage

Arenaviren sind eine Familie von umhüllten, einzelsträngige RNA – Viren , die in erster Linie bei Nagern in der Natur ^1-3 gehalten werden. Während diese Viren normalerweise asymptomatisch, persistierende Infektion in Nagetierreservoirs ^1,2 etablieren, können sie schwere Krankheiten verursachen beim Menschen ^3. Wichtige pathogene Arten gehören die Neue Welt Junin – Virus (JUNV) ⁴ und die Alte Welt Lassa – Virus ^5, die die Erreger der argentinischen hämorrhagisches Fieber in Südamerika und Lassa – Fieber in Afrika sind, beziehungsweise. Lymphatische choriomeningitis Virus (LCMV), das prototypische Virus der Familie ^6, hat eine weltweite Verbreitung und ist verantwortlich für eine Vielzahl von Krankheitszuständen einschließlich aseptischer Meningitis bei immunkompetenten Personen ^6, schwere Geburtsschäden in den sich entwickelnden Fötus ⁷ oder hohe Letalität bei immunsupprimierten Einzelpersonen folgende Festorgantransplantation ^8,9. Der Mangel an USAFood and Drug Administration (FDA) -genehmigte Impfstoffe oder wirksame Virostatika diese Viren unterstreicht die kritische Notwendigkeit zur Bekämpfung neuer Strategien zur Entwicklung therapeutisch diese neuen / wieder auftretender Krankheitserreger zu zielen.

Die Arenavirus – Genom besteht aus zwei einzelsträngigen RNA – Segmente, die große (L) (~ 7,2 kb) und klein (S) (~ 3,6 kb) Segmente ^10. Das S-Segment codiert, das virale Nukleoprotein (NP) und Hüll-Glycoprotein (GP) während der L-Segment die virale Polymerase (L) und Matrixprotein (Z) kodiert. Die L- und S – genomischen RNA – Segmente (vRNAs) in Virionen verpackt ^10-12. Der erste Schritt der Arenavirus – Infektion ist Anlagerung von viralen Partikeln Zellen durch eine Wechselwirkung zwischen dem viralen GP und der entsprechenden Wirtszellrezeptoren für JUNV, die Host, den menschlichen Transferrin – Rezeptor 1 (hTfR1) ^13,14 enthält. Nach Befestigung werden JUNV Partikel in die Zelle über Endozytose ¹⁵ Clathrin-vermittelte genommen.Partikel dann Verkehr zu den späten Endosomen , wo der niedrige pH – Wert dieses Fach die Aktivierung von GP ^16,17 auslöst. Einmal aktiviert, die GP-kodierte Fusionspeptid Einsätze in die endosomale Membran, die Einleitung Fusion zwischen den viralen und endosomalen Membranen. Erfolgreiche Fusion führt zur Freisetzung der Virionen verpackten vRNAs in das Zytoplasma, wo sie als Vorlagen für die genomischen Replikation und Transkription dienen. Wenn ausreichende Mengen an viralen Strukturproteine ​​und vRNAs erzeugt werden, neue Teilchen zusammenstellen und Knospe aus der infizierten Zelle ¹⁸ , um den Lebenszyklus zu vollenden .

Um die Entdeckung neuer Strategien erleichtern, um therapeutisch die pathogenen Arenaviren Ziel hat sich unsere Gruppe auf die Identifizierung von Wirtsfaktoren konzentriert, die für die Virusvermehrung von entscheidender Bedeutung sind, aber entbehrlich für den Host. In diesem Zusammenhang die genaue Stadium der Definition (en) des Zyklus viralen Lebens durch solche Wirtsfaktoren gesteuert ist notwendig, die FührungEntwicklung von antivirale Strategien. Hier beschreiben wir eine quantitative (q) RT-PCR-basierten Assays , die verwendet werden können , Arenavirus-Zellanheftung zur Messung zur Identifizierung , ob ausgewählte Wirtsproteinen und / oder antivirale Moleküle beeinflussen diese Anfangsphase der Viruseintritt ^19. Alternative Ansätze Arenavirus-Zell – Bindung zu messen , haben Virionen mit Biotin ^20, fluoreszierende Farbstoffe ^21, oder radioaktive Isotope ²² markiert gekennzeichnet. Nachteile dieser Verfahren kann das Erfordernis für große Mengen von Eingangs Virus (zB hohe Multiplizität der Infektion (MOI)) umfassen, die Verwendung von Radioaktivität, und / oder zusätzliche Handhabungsschritte Eingangs Virus (zB Konzentration und / oder die Kennzeichnung Virus) vorzubereiten . Insbesondere ermöglicht die Verwendung von hohen MOI es schwierig ^15,23 produktiv im Vergleich zu unproduktiven Befestigung Ereignisse zu unterscheiden. Die qRT-PCR-basierte Test hier beschriebene Befestigungs Ereignisse mit so wenig wie 20 Plaque erkennen fürming Einheiten (PFU) des Virus, die für eine 48-Well-Platte in einer MOI von 0,0004 übersetzt. Daher überwindet die starke Empfindlichkeit des Tests die Forderung nach hoher MOI sowie alle Viren Kennzeichnung oder Konzentrationsschritte. Weiterhin kann die Assay sein i) Virion Endozytose sowie Freisetzung des Virusgenoms in das Cytoplasma nach Fusion und ii) angepasst für die Verwendung mit anderen Viren durch die Entwicklung von virusspezifischen qRT-PCR-Reagenzien (Beispiele zu messen angepasst, siehe ^24-27).